基於哮喘小鼠模型研究生、製百部醇提物作用差異
製劑與炮製
作者：陳曉霞 張曉丹 李紅豔 賈天柱 楊靜嫻
[摘要] 該文以OVA激發小鼠哮喘為模型，分別口服灌胃給予不同濃度生、製百部醇提取物，測定其脾細胞中Th1及Th2釋放的細胞因子，采用RT-PCR技術測定實驗小鼠肺組織中GATA-3及T-bet基因表達，比較生、製百部醇提取物治療小鼠哮喘作用的差異性。結果發現與生品比較，製品給藥後更能上調哮喘小鼠脾細胞中炎症因子IFN-γ（P[1-2]。中醫傳統著述中沒有與CVA完全相對應的病名記載，眾醫家大多將其分屬於“咳嗽”、“風咳”、“肺痹”、“肺痙”、“百日咳”、“咽源性咳嗽”等不同疾病範疇[3]。現代醫學研究認為，百日咳屬於咳嗽變異性哮喘，百部古代及現代一直是治療小兒百日咳的要藥，查閱古典文獻百部治療咳嗽中主要以製百部入藥，現代研究中發現蜜製百部水煎液止咳作用強於生百部[4]，但是目前作者對全國多家醫院、藥店進行調查，發現很多醫生、藥師在使用百部或以百部付方時存在生、製不分的現象。本課題組前期實驗研究也表明蜜製百部水提液及總生物堿部位止咳作用顯著強於生百部，其中總生物堿止咳活性最強[5]，而醇提物中總生物堿溶出率強於其在水煎液中的溶出率，因此本實驗選擇以生、製百部醇提物作為研究對象，首次采用小鼠哮喘模型來考察其止咳作用差異性及其可能的作用機製，以期為傳統中醫理論提供現代醫學證明，為百部臨床使用發揮最佳功效提供一定的指導，為進一步規範百部生熟應用提供支持，為今後進一步深入研究百部總生物堿止咳作用奠定基礎。
1材料
FW100型粉碎機；AS31100A超聲波清洗儀（上海亞榮）；RE-52旋轉蒸發儀（上海亞榮）；超聲噴霧加濕器（上海美的）；Rayto RT-6000酶標儀（深圳雷杜）；細胞XZI顯微鏡（日本Olympus）；BX50生物係統顯微鏡（日本Olympus）；凝膠電泳儀（美國Fisher Biotech）。
刀豆球蛋白A（ConA）、雞卵白蛋白（OVA）、RPMI-1640培養液、小牛血清（FBS）、青鏈黴素、瓊脂、溴化乙啶均購於Sigma公司；IL-2，IL-4，IL-5，IL-13，IFN-γ酶聯免疫試劑購於R&D公司；Trizol購於 Invitrogen公司；RT及PCR試劑盒購於Thermo公司；所有引物均由北京賽百盛科技公司合成；其他化學試劑（天津科密歐）為分析純。湖北產百部購於安徽藥材市場，經遼寧中醫藥大學翟延君教授鑒定為對葉百部。
BALB/c小鼠購於大連醫科大學動物室，合格證號SCXK（遼）2008-0002。
2方法與結果
2.1實驗藥品製備百部製品製備：按照本實驗室前期優化選擇的百部蜜製工藝進行炮製。取生百部片100 g加入22.5 g蜜水（12.5 g蜜，10 g水）悶潤3 h，置預熱的鍋內，以140 ℃翻炒6 min，放涼備用。分別取百部生品及製品粉碎過20目篩，以95%乙醇浸泡3 d，過濾繼續浸泡3 d，合並濾液，45 ℃旋蒸至浸膏，存儲於4 ℃冰箱中，用時以水溶解配置成含生藥2.0，1.0，0.5 g·mL-1的混懸液口服給藥。致敏液配製：稱取OVA 20 mg，加入生理鹽水1 mL中，充分溶解後，取出0.4 mL加入生理鹽水9.6 mL中，混勻，取該液與等體積的佐劑液態鋁混合，40 ℃放置30 min後使用。
2.2動物分組 80隻BABL/c小鼠共分為8組，每組10隻，分別為PBS空白對照組，OVA空白對照組，生百部醇提物高、中、低劑量組，蜜製百部醇提物高、中、低劑量組。
2.3哮喘模型建立及給藥采用係統致敏加局部激發的方法製作哮喘模型[6]。
2.4脾細胞製備小鼠處死，無菌條件下取其脾髒，細胞濾網濾過，於表麵皿加入紅細胞裂解液為細胞濾液的3～5倍，裝入EP管中，室溫震蕩5 min，4 ℃離心機1 200×g離心10 min，棄去上清，以培養液洗沉澱後1 200×g 離心10 min。最後向沉澱加入RPIM 1640培養液。
2.5ELISA試劑盒測定將脾細胞濃度調整為1×107個/mL，接種於24孔板，於37 ℃，5%CO2的無菌條件下培養48 h，加入ConA（終濃度為5 g·L-1），同時設空白組，繼續培養48 h，取上清液置-80 ℃冰箱保存待用。IL-2，IL-4，IL-5，IL-13，IFN-γ ELISA試劑盒的測定按照試劑盒說明進行。實驗結果表明，OVA激發的哮喘組中Th1細胞因子IFN-γ及IL-2較PBS組均降低，給藥組上調這些細胞因子。與生品比較，製品具有更強的上調IFN-γ能力；哮喘組中Th2細胞釋放的IL-4，IL-5，IL-13均較PBS組中的有顯著的增加，而生、製醇提物均能下調其釋放量，但對IL-4的下調除了中劑量外其他均沒有顯著性差異；生、製品對IL-13有顯著性的下調，其中製品的高劑量下調能力較生品強；生、製品中、高劑量對IL-5顯著的下調，且製品均較生品更為顯著。
2.6總RNA提取取實驗小鼠肺組織樣品按50～100 g·L-1加入Trizol，按照說明書提取總RNA。
2.7一步法RT-PCR 引物β-Actin：Forword 5′-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3′；Reverse 5′-TTTGATGTCACGCACGATTT-3′；GATA-3：Forword 5′ -AGGGCTACGGTGCAGAGGTA-3′；Reverse 5′-CGGAGGGTAAACGGACAGAG-3′；T-bet：Forword 5′-CCCATTCCTGTCCTTCACCG-3′；Reverse 5′-CATGCTGCCTTCTGCCTTTC-3′。