在線二維液相色譜法快速測定桂枝茯苓膠囊中芍藥苷、丹皮酚、苦杏仁苷和肉桂酸的含量
製劑與炮製
作者：張豔海 張大偉 孟兆青 劉綠葉 金燕
[摘要] 使用雙梯度液相色譜係統和紫外檢測器，建立在線二維液相色譜方法，同時測定桂枝茯苓膠囊中芍藥苷、丹皮酚、苦杏仁苷和肉桂酸的含量。采用雙梯度液相色譜的其中一個泵為一維分離泵，以乙腈為有機相，0.08%磷酸+0.08%三乙胺為水相，梯度洗脫，采用 C18色譜柱（3.0 mm×150 mm，3 μm），流速0.5 mL·min-1；利用雙梯度液相色譜的另外一個泵為二維分離泵，以乙腈為有機相，以20 mmol，pH 3.0的磷酸二氫鉀為水相，梯度洗脫，采用PAⅡC18色譜柱（4.6 mm×150 mm，3 μm），流速0.8 mL·min-1；檢測波長218，230，275 nm，采用波長切換方式。芍藥苷、丹皮酚、苦杏仁苷和肉桂酸的線性範圍分別為5.55～222，6.6～264，3.3～132，0.315～12.6 mg·L-1；r分別為0.999 7，0.999 5，0.999 8，0.999 7；4個成分的平均回收率在96.12%～103.9%。該方法快速，測定結果準確可靠，可用於評價藥物質量。
[關鍵詞]二維液相色譜；雙梯度液相色譜；桂枝茯苓膠囊；苦杏仁苷；肉桂酸
高效液相色譜已成為中藥複雜體係研究的重要技術，隨著新型色譜柱填料和鍵合技術的發展，為中藥中各類成分的分離提供了多種選擇，然而中藥的複雜性已遠遠超出了人們的設想，Davis等[1]曾經指出用一維分離方法對含有100個隨機組分的樣品進行分離，完全分離82個組分，至少需要400萬的理論板數，且當色譜峰的數量超過峰容量的37%時，係統的分離度會大大降低，所以在現有技術條件下，期望如此高的柱效和峰容量是不切實際的。多維液相色譜分離是液相色譜發展的一個重要方向，它是將多種不同分離機製的色譜體係進行聯用，增加了色譜係統的分離能力，擴大了分離空間，提高了係統的峰容量，可以滿足複雜樣品的分離要求。在多維色譜分離手段中，二維分離最為常見。二維色譜根據一維組分是否直接進入到第二維進行分離可分為離線[2-4]和在線[5-6]2類，其中在線方法具有自動化程度高、避免人為誤差及加快樣品分析效率等優點，二維液相色譜分離技術已被越來越多的應用到中藥的研究中[7-9]。
桂枝茯苓膠囊係漢代張仲景《金匱要略》古方桂枝茯苓丸的改進劑型，經現代製造工藝精製而成為純中藥製劑，由桂枝、牡丹皮、桃仁、赤芍和茯苓組成。在2010年版《中國藥典》中收載的桂枝茯苓膠囊含量測定項下分別采用3種高效液相色譜法測定丹皮酚、芍藥苷和苦杏仁苷的含量[10]，不僅實際樣品的分析效率較低，且缺乏來自桂枝中的指標性成分。本文利用雙梯度高效液相係統（dual gradient liquid chromatography，DGLC）在線二維色譜分離技術，樣品提取後，溶液直接進樣分析，並同時測定了肉桂酸的含量，含量測定結果與原方法基本一致，且樣品分析效率大大提升，可用於桂枝茯苓膠囊的質量分析。
1材料
雙三元液相色譜RS係統（美國賽默飛世爾公司），配置6通道真空脫氣機SRD3600，雙梯度分析型色譜泵DGP3600RS，自動進樣器WPS3000TSL，柱溫箱TCC-3000（配有1個六通閥和1個十通閥），二極管陣列檢測器DAD3000RS，變色龍色譜管理軟件Chromeleon 6.8 SR11；Acclaim PAⅡ（4.6 mm×150 mm，3 μm，美國賽默飛世爾公司，批號）；Acclaim C18色譜柱（3.0 mm×150 mm，3 μm，美國賽默飛世爾公司，批號）。
磷酸二氫鉀（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；乙腈、甲醇（色譜級，Fisher公司）；去離子水（18.2 MΩ，Millipore）；丹皮酚對照品（paeonol，純度96.8%，中國食品藥品檢定研究院，批號-）；芍藥苷（peniflorin，純度>98%，上海安譜，STA-）；苦杏仁苷（amygdaloside，純度>99%，上海安譜，STA-）；肉桂酸（cinnamic acid，純度>99%，上海安譜，STA-）。桂枝茯苓膠囊（江蘇康緣藥業股份有限公司，產品批號，，）。
2方法和結果
2.1色譜條件一維分析泵的流動相A為乙腈，流動相B為0.08%磷酸+0.08%三乙胺，Acclaim 120 C18為一維分析柱，流速為0.5 mL·min-1，梯度洗脫，0～10 min，15%A，10～25 min，15%～75%A，25～30 min，75%～85%A，30～33 min，85%A，33～35 min，85%～15%A；二維分析泵的流動相A為乙腈，流動相B為20 mmol，pH 3.0的磷酸二氫鉀，Acclaim PAⅡC18為二維分析柱，梯度洗脫程序，0～5 min，5%A，5～15 min，5%～40%A，15～15.2 min，40%～5%A，15.2～20 min，5%A，20～30 min，5%～70%A，30～35 min，70%A，流速0.8 mL·min-1，柱溫35 ℃，檢測波長0～10 min，230 nm，10～15 min，218 nm，15～35 min，275 nm，進樣量5 μL。