人參皂苷Rb1改善高脂喂養肥胖小鼠胰島素抵抗和脂肪異位沉積
藥理
作者：尚文斌 於希忠 王國強 趙娟
[摘要] 人參皂苷Rb1是人參的主要活性成分，前期體外實驗顯示人參皂苷Rb1能夠抑製脂肪細胞脂肪分解和促進葡萄糖轉運的作用。本研究利用高脂飲食誘導的肥胖小鼠，研究人參皂苷Rb1對胰島素抵抗和脂肪異位沉積的影響及其作用的分子機製。將高脂喂養的肥胖雄性C57/L小鼠，隨機分為高脂組（DIO組），人參皂苷Rb1組（Rb1組）和羅格列酮組（Rog組），繼續給予高脂飼料喂養，另設立正常飼料喂養的C57/L小鼠為正常組（NC組）；分別按20，10 mg·kg-1體重給予Rb1組和Rog組小鼠每天腹腔注射人參皂苷Rb1和羅格列酮，NC組和DIO組以等量的生理鹽水腹腔注射。治療2周後，進行腹腔注射葡萄糖耐量試驗（IPGTT），3 d後，處死小鼠，留取血清，檢測胰島素、遊離脂肪酸（FFA）及生化指標；稱取肝髒質量，檢測肝髒內甘油三酯含量和病理檢測；稱取附睾脂肪質量，蛋白印跡檢測PDE3B，HSL，周脂素。結果顯示人參Rb1治療2周明顯改善肥胖小鼠的葡萄糖耐量，除了0～120 min，Rb1組葡萄糖耐量曲線下麵積（0～30，0～60，0～90 min）較DIO組均顯著下降（P[1]，而人參皂苷Rb1是人參的最主要的活性成分。作者的前期體外研究發現人參皂苷Rb1促進3T3-L1前脂肪細胞向脂肪細胞的分化並抑製脂肪分解，減少遊離脂肪酸（FFAs）的釋放[2-3]，並且通過激活胰島素信號通路促進脂肪和肌肉細胞的葡萄糖轉運，表明其有胰島素樣的作用[4]，這些結果部分闡明了人參皂苷Rb1的抗糖尿病作用的分子機製，但是人參皂苷Rb1對於機體整體胰島素敏感性的影響以及抑製脂肪酸溢出的分子機製尚缺乏深入研究。本研究利用高脂喂養的肥胖小鼠模型，觀察人參皂苷Rb1對機體胰島素敏感性和脂肪異位沉積的影響，並探索其可能的機製。
1材料
1.1動物 6周齡健康雄性、體重20 g左右C57/L小鼠，購自上海斯萊克實驗動物責任公司，動物許可證號SCXK（滬）2007-0005。
1.2試劑普通飼料熱量組成碳水化合物占60%、蛋白質22%、脂肪10%、纖維素和其他成分8%，高脂飼料：豬油20%、白糖4%、奶粉2%、膽固醇1%、普通飼料73%，2種飼料均購自上海斯萊克實驗動物責任公司。人參皂苷Rb1及羅格列酮購自中國食品藥品檢定研究院；小鼠遊離脂肪酸試劑盒購自日本Wako公司；小鼠胰島素ELISA試劑盒購自瑞典Mercodia公司；TG測定試劑盒購自美國Sigma公司；抗β-actin抗體、抗HSL抗體、Phospho-HSL （Ser563）、抗perilipin抗體和羊抗兔第二抗體均購自美國Cell Signaling technology；ECL化學發光檢測試劑盒、BCA蛋白檢測試劑盒購自Pierce公司。
1.3儀器
血糖儀（One Touch Ultra EasyTM）購自強生（中國）醫療器械有限公司，酶標儀購自BioTek公司，電泳儀、半幹轉膜係統均購自Bio-Rad公司。
2方法
2.1造模及給藥將38隻小鼠分為2組，分別為正常飼料組（NC，n=8）和高脂飼料組（n=30），高脂飼料組喂養24周後，選取造模成功的肥胖小鼠隨機分為3組：模型組（DIO）、人參皂苷Rb1組（Rb1）和羅格列酮組（Rog），每組8隻，繼續給予高脂飼料喂養。並分別按20，10 mg·kg-1體重給予Rb1組和Rog組小鼠每天腹腔注射人參皂苷Rb1和羅格列酮，NC組和DIO組以等量的生理鹽水腹腔注射。治療2周後進行腹腔注射葡萄糖耐量試驗（IPGTT），IPGTT結束後3 d，斷頭處死小鼠，取血，3 000 r·min-1離心10 min，留取血清，-70 ℃保存，並稱取肝髒、附睾脂肪質量，迅速置於液氮中保存，部分肝髒置於4%多聚甲醛中固定。小鼠自由攝食飲水，每周稱重2次。
2.2IPGTT 小鼠禁食12 h後，次日清晨50%葡萄糖按2 g·kg-1體重腹腔給藥，分別在0，30，60，120 min取血針尾靜脈采血，血糖儀測血糖值。
2.3生化指標測定遊離脂肪酸（FFA）和血清胰島素均按照劑盒說明書操作；血清總膽固醇（Tch）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）由南京中醫藥大學附屬醫院檢驗科以生化法檢測。
2.4胰島素抵抗指數（HOMA-IR） HOMA-IR=空腹血糖水平×空腹胰島素水平/22.5。
2.5肝髒內TG含量測定參照文獻方法[5]，抽提肝髒內TG，用TG試劑測定。
2.6肝髒病理檢測多聚甲醛固定後的肝髒，浸蠟包埋切片，常規HE（蘇木精-伊紅）染色，顯微鏡下觀察並攝片。
2.7附睾脂肪蛋白印記檢測將待測脂肪組織放入預冷的玻璃勻漿器中，加入組織裂解液和蛋白酶抑製劑的混合物充分研磨組織，研磨過程在冰上操作。4 ℃，13 000 r·min-1離心30 min，吸取上清，用BCA法檢測蛋白樣品濃度。加入上樣緩衝液，95 ℃變性5 min，用10% SDS-PAGE分離蛋白，轉膜後用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫雜交2 h，洗膜後，壓片顯影檢測蛋白。
2.8統計學分析所有數值以±s表示，采用SPSS 12.0軟件進行統計分析，組間差異比較采用t檢驗，P[6]。肥胖和2型糖尿病患者體內脂解增加，FFAs過多外溢，循環FFAs明顯升高，可幹擾胰島素的信號轉導，導致胰島素抵抗，減少肌肉葡萄糖攝取氧化和糖原合成，增加肝髒糖異生和糖原分解，又可導致脂肪異位沉積於肌肉和肝髒，引起和加重糖耐量異常和糖尿病[6]，而持續升高的FFA不僅降低肌肉、脂肪和肝髒對胰島素的敏感性，而且影響胰腺β細胞胰島素的分泌功能，即所謂的脂毒性（lipotoxicity）。所以，調節機體的脂解，防止遊離脂肪酸的過度外溢和異位沉積是維持機體能量代謝平衡、防治胰島素抵抗和代謝性疾病的重要手段[7]。