槐定堿抗骨癌痛作用及其機製研究
藥理
作者：嚴繼貴 楊宇清 王雅潔 闞晶
[摘要] 目的：采用W256癌細胞誘導的骨癌痛模型大鼠探討槐定堿抗癌痛藥效及其作用機製。方法：采用骨髓腔注射W256癌細胞複製骨癌痛大鼠模型；造模10 d後選取模型複製成功的大鼠36隻隨機分為模型對照組及槐定堿治療組，另取同期10隻大鼠作為正常對照組；治療組大鼠於造模第15天開始給予槐定堿25 mg·kg-1治療10 d；各組大鼠給藥前、後測量機械痛閾和熱痛閾，末次給藥後，對大鼠患肢進行放射學和組織病理學觀察，並采用免疫組化法檢測大鼠患肢腫瘤組織環氧酶-2（COX-2）、血管內皮生長因子（VEGF）的表達。結果：槐定堿可明顯提高骨癌痛大鼠機械痛閾和熱痛閾值（P[1-3]。已開發的製劑“鹽酸槐定堿注射液”目前在臨床上僅試用於惡性滋養細胞腫瘤的治療，尚有較多的適應症有待進一步開發。本研究旨在采用W256癌細胞誘導的骨癌痛模型代替傳統的疼痛模型，對槐定堿的抗癌痛作用進行初步藥效觀察和部分機製探討，為槐定堿的進一步開發和增加新的臨床適應證提供理論和實驗依據。
1材料
1.1藥品與細胞株槐定堿，純度≥98%（南京景竹生物科技有限公司）；W256癌細胞，由浙江醫學科學院提供腹水癌細胞種鼠，經本課題組純化培養所得。
1.2試劑乙二胺四乙酸二鈉（天津市頂福化工總廠）；戊巴比妥鈉（上海化學試劑公司）；25%戊二醛（上海化學試劑采購供應站五聯化工廠）；二甲苯（上海化學試劑公司）；無菌骨蠟（安徽省第二人民醫院提供）；COX-2免疫組化試劑盒（SP濃縮型，北京中山生物技術有限公司）；VEGF免疫組化試劑盒（武漢博士德生物技術有限公司）。
1.3動物雌性SD大鼠，清潔級，體重180～200 g，購自浙江中醫藥大學實驗動物中心，合格證號SYXK（浙）2012-0013。
1.4儀器 XZC-A型壓力測痛儀（山東醫學科學院）；XZC-2B型自控溫度熱板儀（山東省醫學科學院）；石蠟切片機 M3500（深圳威斯比生物科技發展有限公司）；高頻乳腺攝片機（意大利）； C3040-ADUS型光學顯微鏡照像係統（日本OLYMPUS公司）。
2方法
2.1骨癌痛模型複製與鑒定按照文獻所述方法製備W256癌細胞懸液和複製骨癌痛模型[4-5]：取雌性SD大鼠40隻，左後肢去毛消毒、麻醉，手術切開脛骨中上端皮膚約0.5～1.0 cm，暴露脛骨，先用7號針頭穿刺打孔，再用5 μL微量注射器向骨髓腔注入3 μL約含4×103個W256癌細胞的細胞懸液，骨蠟封住針孔，縫合切口。大鼠術後常規飼養10 d後，戊巴比妥鈉麻醉，將患肢置高頻乳腺攝片機下攝片觀察，選取脛骨上端出現明顯缺損灶的大鼠用作實驗。
2.2分組與給藥選取模型複製成功的36隻大鼠，隨機分為模型對照組和槐定堿治療組，每組18隻；另取同期10隻大鼠以生理鹽水代替癌細胞懸液注入骨髓腔作為正常對照組。自術後第15天開始給藥。其中，槐定堿治療組腹腔注射槐定堿水溶液25 mg·kg-1（按體表麵積計算，相當於臨床推薦最大劑量），對照組和模型組腹腔注射等體積生理鹽水，各組大鼠每天給藥1次，共10 d。
2.3痛閾測量各組大鼠分別於給藥前和給藥後，參照文獻所述方法[5]，采用足趾壓痛法和熱板法分別測量機械痛閾及熱痛閾的變化。機械痛閾測量：將大鼠患肢足掌置於壓力測痛儀壓力針下，啟動電動按鈕，以出現嘶叫或縮足為痛反應，此時所需壓力值（×10 g）即為該動物的機械痛閾值。熱痛閾測量：調節熱板儀溫度至（52±0.1）℃，然後將大鼠置於熱板上，以大鼠出現添後足時所需時間作為該動物的熱痛閾值。上述痛閾測量每隻大鼠均需測量2次，且間隔3 min以上，取2次均值作為該動物的痛閾值。
2.4放射學觀察各組大鼠於末次給藥後，3%戊巴比妥鈉麻醉，將患肢置高頻乳腺攝片機下攝片，並參照文獻所述方法進行骨損傷評分[5]。
2.5病理學觀察（HE染色）攝片後脫頸椎處死大鼠，剪下患肢，分離脛骨並修剪，取患骨0.3～0.5 cm，4%中性甲醛固定3 d，10%EDTA（pH 7.0～7.4）脫鈣4周，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規切片，HE染色，光鏡觀察並攝片。