寒涼藥對熱證大鼠肝線粒體蛋白質組的影響
藥理
作者：李毅 盧德趙 唐利華 沃興德 楊貞
[摘要] 自20世紀60年代起，現代科學開始對熱證的本質進行研究，但有關熱證的病理機製和寒涼藥物的作用機製等尚未深入係統研究。該研究以具有代表性的熱性中藥喂飼動物造成熱證模型，後用寒涼藥進行實驗性治療，擬采用雙向電泳及質譜分析技術對熱證模型大鼠及寒涼藥治療後的大鼠肝線粒體蛋白組進行比較，從中發現熱證及寒涼藥治療後的特異性相關蛋白質。
[關鍵詞]寒涼藥；熱證；線粒體；蛋白質組
寒熱是用以概括機體陰陽盛衰的兩類證候。祖國醫學認為“陽勝則外熱”、“陰虛則內熱”，在臨床上熱證主要表現為：惡熱喜冷，煩躁不安，口眼幹燥，麵紅目赤，咳痰黃稠，舌紅脈數等，綜合起來以基礎代謝率偏高，機體能量過剩為特征。熱證的形成機理有很多，中醫古籍《黃帝內經》等對其病因均有介紹，自20世紀60年代起，現代科學開始對熱證的本質進行研究，然而目前有關熱證的病理機製和寒涼藥物的作用機製等，尚未深入係統研究[1]。
肝髒是人體重要的代謝器官，肝細胞中的線粒體則是重要的細胞器，是細胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，在能量代謝中發揮著重要的作用。本研究以具有代表性的熱性中藥喂飼動物造成熱證模型，後用寒涼藥進行實驗性治療，擬采用雙向電泳及質譜分析技術對熱證模型大鼠及寒涼藥治療後的大鼠肝線粒體蛋白組進行比較，從中發現熱證及寒涼藥治療後的特異性相關蛋白質，在線粒體蛋白質組水平闡述中醫熱證能量代謝障礙的內在物質基礎及寒涼藥的作用機製，進而指導中醫的臨床診斷與治療。
1材料與方法
1.1藥材與試劑所有中藥均采購於杭州方回春堂藥店。溫熱藥以附子、幹薑、肉桂按1∶1∶1比例，常規煎2次，合並濃縮至1 g·mL-1；寒涼藥以黃芩、黃連、黃柏按1∶1∶1比例，常規煎2次，合並濃縮至1 g·mL-1。雙向電泳相關試劑均購自Bio-Rad公司，酶解試劑均購自Sigma公司。
1.2動物分組及造模清潔級SD雄性大鼠18隻，體重180～220 g，購自浙江大學動物實驗中心，隨機分為正常對照組、熱證模型組和藥物治療組。參照徐誌偉等[2]的實驗方法，正常對照組動物正常飲食，每鼠每日灌喂生理鹽水4 mL，共4周；熱證模型組每鼠每日灌以溫熱藥4 mL（約含4 g生藥），造模2周後繼續每鼠每日4 mL生理鹽水灌胃2周；藥物治療組為造模2周後每鼠每日繼續灌以寒涼藥4 mL（約含4 g生藥）2周。
1.3常規生理指標檢測 4周後開始分別測定3組大鼠體重增長值，24 h尿量，飲水量和飲食量，並測定肛溫。
1.4血清激素含量測定 4周後采用眼眶後靜脈叢取血法。每組每隻大鼠采血3～4 mL，分離出血清，運用雙抗體夾心化學發光兩步法檢測血清T3，T4含量；應用固相競爭化學發光酶免疫分析法測定睾酮含量。
1.5大鼠線粒體蛋白質提取及差異蛋白質分析 4周後處死大鼠，取肝髒勻漿，按文獻方法提取肝髒線粒體蛋白質[3-4]，進行雙向電泳，每組重複3次。經UMAX ImageScanner凝膠掃描儀掃描圖譜，運用ImageMaster軟件分別進行兩兩比較。分別取2組間相互匹配且具有明顯表達差異（Variation>2.0，P[5]。中醫認為：陽盛則熱，與對照組比較，模型組大鼠血清T3，T4明顯升高；在經過寒涼藥治療後血清T3，T4顯著降低。睾酮可使血循環增加，增加促血紅素生成，提高血紅蛋白含量，符合熱證特征，為構成熱證的因素之一[6]。與對照組比較，模型組大鼠血清睾酮含量顯著升高，而寒涼藥治療後顯著降低。
2.3大鼠肝髒線粒體蛋白質組學分析經圖譜分析，對照組3塊凝膠的平均蛋白質點為962個，模型組3塊凝膠的平均蛋白質點為816個，寒藥治療組6塊凝膠的平均蛋白質點為993個。分別進行兩兩比較，與對照組相比，熱證模型組有12個蛋白質表達顯著改變；與模型組相比，寒藥治療組有17個蛋白質表達顯著改變。
3分析與討論
3.1熱證治療前後糖、脂肪、蛋白質代謝的變化熱證大鼠中與糖和蛋白質代謝降低，主要表現為與糖代謝有關的乙醛脫氫酶和與蛋白質代謝有關的異戊酰輔酶A脫氫酶（反映人體內亮氨酸代謝情況）和3-巰基丙酮酸硫基轉移酶（反映人體內胱氨酸代謝情況）表達降低，該抑製可能由於內熱引起的糖和蛋白質代謝過盛引起的反饋抑製。