養陰益氣活血方藥對幹燥綜合征NOD小鼠頜下腺Fas/FasL及其mRNA表達的影響
藥理
作者：吳國琳 李天一 盧雯雯 餘國友 範永升
[摘要] 目的：觀察養陰益氣活血方藥對幹燥綜合征NOD小鼠頜下腺組織Fas/FasL及其mRNA表達的影響。方法：32隻NOD小鼠隨機分為模型組、中藥組（每天按100 g·kg-1灌胃養陰益氣活血煎劑0.4 mL）、羥氯喹組（每天按60 mg·kg-1灌胃羥氯喹0.4 mL）、中西藥組（每天灌胃養陰益氣活血煎劑50 g·kg-1+羥氯喹60 mg·kg-1，0.4 mL），每組8隻，選8隻Balb/C小鼠做為正常對照組。實驗進行8周後處死小鼠，解剖摘取頜下腺，免疫組織化學法檢測頜下腺組織Fas，FasL蛋白的表達；RT-PCR法檢測頜下腺組織Fas，FasL mRNA的表達。結果：模型組小鼠頜下腺組織Fas，FasL表達均高於其他各組（P[1]。臨床主要表現為口幹、眼幹、關節酸痛、便秘、皮膚幹燥、鼻腔幹燥等症狀，嚴重者影響患者生活質量。目前幹燥綜合征的病因和發病機製尚不清楚。有研究[2]發現Fas/FasL在SS患者唇腺組織細胞和導管上皮內大量表達，浸潤的淋巴細胞內很少表達FasL。提示Fas/FasL在SS唇腺腺胞及導管上皮細胞內的異常表達可能是SS患者唾液腺破壞的一個重要機製。通過前期臨床研究觀察，運用中藥養陰益氣活血中藥配合西藥治療SS療效確切[3-4]。動物實驗研究表明，其具有改善NOD小鼠唾液分泌量、減少飲水量以及改善小鼠頜下腺淋巴病理浸潤的作用[5]，同時能調節小鼠血清和頜下腺Th1型細胞因子TNF-α和Th2型細胞因子IL-1β水平[6]。為此，通過研究中藥養陰益氣活血煎劑對幹燥綜合征NOD小鼠頜下腺組織Fas，FasL蛋白及其mRNA表達的影響，以進一步明確其治療幹燥綜合征的可能機製。
1材料
1.1動物選擇NOD小鼠32隻及Balb/C小鼠8隻，8周齡，雌性，均為SPF級，於無特殊病菌的恒溫恒濕度條件下喂養。實驗動物均由上海斯萊克動物實驗中心提供，動物合格證號26。
1.2藥品中藥養陰益氣活血煎劑（由太子參24 g、白芍15 g、玉竹12 g、五味子10 g、黃精15 g、烏梅10 g、紅景天15 g、腫節風12 g、青蒿15 g、桑椹12 g等中藥組成），所有中藥飲片均購於浙江大學醫學院附屬第一醫院中藥房，由浙江中醫藥大學中藥實驗室煎製濃縮而成。製備方法：將藥物按組方比例混合，裝入三角燒瓶中，加10倍量水浸泡1 h，電磁爐加熱煮沸後，改用文火煎煮2 h，過濾藥液；藥渣再加8倍量水煮沸1 h，藥渣共煎煮2次，合並3次濾液，濃縮成質量濃度為6 g·mL-1的藥液，4 ℃冰箱保存備用。硫酸羥氯喹片（上海中西製藥有限公司，批號），用蒸餾水稀釋成含生藥量3 g·L-1。
1.3試劑兔抗鼠Fas，FasL多克隆抗體（一抗）（美國Santa Cruz公司）；Sp-9001（北京中杉金橋分裝Zymed，18 mL，批號）；Pv-9003（北京中杉金橋分裝Zymed，3 mL，批號）；Fas，FasL原位雜交檢測試劑盒（武漢博士德公司）；原位雜交檢測試劑盒（武漢博士德公司）；原位雜交專用PBS（武漢博士德公司）；反轉錄試劑盒（TAKARA公司）。
2方法
2.1動物分組將32隻NOD小鼠隨機分為4組，即模型組、中藥組、羥氯喹組、中西藥組，每組8隻。Balb/C小鼠8隻做為正常對照組。實驗動物均喂養於無特殊病菌的恒溫恒濕度條件下，飲水瓶給水。
2.2給藥方法對照組和模型組每天正常飼養。各給藥組在正常飼養基礎上，於實驗開始後每天定時給藥1次，給藥量按動物與人等效劑量換算表計算（相當於臨床人用藥劑量9倍）。中藥組每天按照100 g·kg-1劑量分別灌胃養陰益氣活血煎劑0.4 mL。羥氯喹組每天按照60 mg·kg-1劑量灌胃羥氯喹片稀釋液0.4 mL；中西藥組每天分別灌胃中藥+羥氯喹（養陰益氣活血煎劑50 g·kg-1+羥氯喹60 mg·kg-1）0.4 mL。實驗進行8周後處死小鼠，解剖摘取雙側頜下腺進行指標檢測。實驗至第2周，中藥組有1隻小鼠死亡，經解剖後發現是因灌胃不當引起食管損傷而死。
2.3免疫組化法檢測小鼠頜下腺組織Fas，FasL含量動物給藥喂養8周後，處死後摘取雙側頜下腺組織，采用免疫組化SP法檢測小鼠頜下腺組織Fas，FasL含量，具體步驟嚴格按照說明書操作。采用多功能真彩色細胞圖象分析管理係統進行圖像分析，選取400倍圖像，細胞質或胞膜著棕黃色為陽性表達細胞。選擇有意義的組織相，經登錄、編號、采集、分析、讀取數據。隨機選取5個視野進行平均吸光度測定，取其平均值作為該切片的代表值進行統計分析。
2.4Real-time PCR法檢測小鼠頜下腺組織Fas，FasL mRNA的表達以GAPDH為內參，實驗過程按試劑盒說明書進行，具體步驟如下：用Trisol試劑盒提取頜下腺總RNA，取1 μL進行RT-PCR分析。Fas引物序列為上遊5′-AGGCCGCCCGCTGTTTTC-3′，下遊5′-ACGAACCCGCCTCCTCAGC-3′，產物長度145 bp，Tm值60；FasL引物序列為上遊5′-GCCGCCACTGACCCCTCTAA-3′，下遊5′-CCACACTCCTCGGCTCTTTT -3′，產物長度242 bp，Tm值60；GAPDH引物序列為上遊5′-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3′，下遊5′-TGAAGGGGTCGTTGATGG-3′，產物長度108 bp，Tm值60。PCR反應參數為94 ℃ 5 min，再將反應條件變為94 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，循環擴增40次。60 ℃檢測熒光值。