咖啡酸在大鼠體內的絕對生物利用度及其在腸道吸收特性的研究
藥代動力學
作者：曾潔 王素軍 楊本坤 鍾運鳴 臧林泉 王羚酈
[摘要] 目的：研究咖啡酸在大鼠體內的絕對生物利用度及其在腸道的吸收特性。方法：大鼠分別采用靜脈（2 mg·kg-1）、灌胃（10 mg·kg-1）給藥研究咖啡的絕對生物利用度；建立大鼠原位腸血管灌流模型研究咖啡酸在腸道的吸收率；采用Caco-2細胞模型研究咖啡酸的雙向轉運情況。結果：咖啡酸靜脈（2 mg·kg-1）、灌胃（10 mg·kg-1）給藥後，在大鼠體內的藥動學行為均符合二室模型，咖啡酸的絕對生物利用度為14.7%；咖啡酸在腸血管灌流模型中的吸收率為12.4%；咖啡酸的PappAP→BL及PappBL→AP不隨濃度的變化而變化，且在實驗濃度的範圍內，PappBL→AP/PappAP→BL均大於2。結論：咖啡酸絕對生物利用度低，腸道吸收率少，在Caco-2細胞單層模型中的轉運途徑可能為主動轉運。
[關鍵詞]咖啡酸；生物利用度；腸吸收率；通透性
咖啡酸（3， 4-二羥基肉桂酸）是自然界中分布非常廣泛的多酚類化合物，具有抗氧化、抗菌、抗癌等作用[1-3]。有研究報道，每天攝食一定量的咖啡酸可以預防肝癌、皮膚癌[4-5]。咖啡酸是咖啡酸片主要成分，臨床上用於止血。據報道咖啡酸的代謝部位主要是小腸，經腸道細菌代謝[6]。咖啡酸在大鼠血漿中代謝物主要是葡醛酸結合物、硫酸結合物及少量的原型藥物[7]。少有文獻報道咖啡酸的絕對生物利用度，因此，本文采用傳統的體內法研究咖啡酸在大鼠體內的絕對生物利用，建立大鼠原位腸血管灌流法研究咖啡酸的腸吸收率及運用Caco-2細胞模型研究咖啡的通透性，旨為咖啡的臨床應用提供理論指導。
1材料
咖啡酸（-）、肉桂酸（-）購自中國食品藥品檢定研究院；牛血清白蛋白購自齊雲生物技術有限公司；DMEM 培養基、胎牛血清、非必需氨基酸購自美國Hyclone 公司；L-穀氨酰胺、胰蛋白酶，購自美國Sigma 公司。乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。
血管灌流Krebs-Ringer′s 液的配製：稱取NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，CaCl2 0.37 g，MgCl2 0.22 g，NaH2PO4 0.32 g，葡萄糖 3.0 g，NaHCO3 1.37 g，蒸餾水定容至1 L，臨用前加入5%牛血清白蛋白。HBSS溶液的配製：稱取8 g NaCl，0.4 g KCl，1 g 葡萄糖，60 mg KH2PO4，47.5 mg Na2HPO4，調pH至7.2，加蒸餾水定容至1 L。
4000Q TRAP 串聯四極杆質譜儀（美國Applied Biosystem 公司）；LC-20AD 高效液相色譜儀（日本島津公司）；細胞培養箱（德國Hearous 公司）；24 孔Transwell培養板（美國Costar 公司）；Millicell-ERS跨膜電阻儀（美國Millipore 公司）；飛鴿高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；HL-2D 恒流泵（上海精科實業有限公司）。
SD 大鼠，雄性，體質量200～250 g，購自廣州中醫藥大學實驗動物中心，許可證號SCXK（粵）2008-0020。
2方法
2.1分析方法
2.1.1色譜條件色譜柱為Phenomenex C18柱（2.0 mm×50 mm，5 μm），柱溫30 ℃；流動相A 為甲醇-水（5∶95）和10 mmol·L-1醋酸銨，流動相B為甲醇-水（95∶5）和10 mmol·L-1醋酸銨；梯度洗脫程序如下：0～0.5 min，0%B；0.5～0.8 min，0～100%B；0.8～3.0 min，100%B；3.0～3.2 min，100%～0 B；3.2～5.0 min，0%B；流速0.2 mL·min-1；進樣量10 μL。
2.1.2質譜條件 ESI離子源；MRM檢測模式；檢測離子為負離子[M-H]-；離子源溫度550 ℃；離子噴霧電壓-4 500 V；Gas 1為0.379 MPa；Gas 2為0.379 MPa；氣簾氣壓0.138 MPa；咖啡酸和內標肉桂酸的檢測離子對分別為m/z：178.9/134.8，146.8/102.8。
2.2咖啡酸體內藥動學考察
12隻SD大鼠隨機平均分成2組，分別為靜脈注射組和灌胃組。靜脈注射組大鼠按2 mg·kg-1於股靜脈注射給藥，並與給藥後0.083，0.167，0.5，1，2，3，5，8，12 h 眼球後靜脈叢采血0.5 mL。灌胃組大鼠按10 mg·kg-1的劑量灌胃給予咖啡酸，於給藥後0.083，0.167，0.333，0.5，1，2，3，4，6，12 h 眼球後靜脈叢采血0.5 mL。分離血漿，甲醇溶液沉澱蛋白後低溫保存（-20 ℃）待測。
2.3大鼠原位腸血管灌流模型製備與檢測
大鼠原位腸血管灌流模型在原位腸肝血管灌流模型的基礎上稍作修改[8-10]。大鼠20%烏拉坦（0.6 mL·kg-1）麻醉後，腹部切口，結紮腹腔動脈與肝動脈，將上腸係膜動脈、右腎動脈和腹主動脈遊離出來，用線圍繞主動脈與右腎動脈和上腸係膜動脈分支處上下鬆結紮，右腎動脈在靠近右側腎門處紮緊，在進入上腸係膜動脈前一點做一切口用於插管，插管固定後立即開通灌流，體積流量5 mL·min-1。隨即幽門靜脈上作一切口，插管，固定插管後將體積流量提高至10 mL·min-1。將上述鬆結紮處紮緊，並在心髒與肝髒之間，結紮下腔靜脈。用加熱燈泡維持模型溫度在37 ℃左右，先用不含藥的灌流液衝洗幹淨血管中的殘血，隨後用含藥的灌流液灌流，預平衡15 min。其後，換用100 mL 灌流液進行灌流，此時作為實驗的零時間點並同時在十二指腸給予咖啡酸5 mg·kg-1，分別於0，5，15，30，45，60，75，90，105，120 min 從儲備瓶中采樣1 mL，並同時補充相同體積的灌流液，測定灌流液中咖啡酸的濃度。咖啡酸腸道吸收率采用如下公式計算：腸吸收率=×100%。Cend為120 min時咖啡酸在儲液瓶中的濃度，mg·L-1；D為咖啡酸的初始濃度；100為灌流液的體積。
2.4Caco-2細胞模型
2.4.1細胞培養 Caco-2 細胞（傳代≤40代）接種於培養瓶中，DMEM培養液內含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1% L-穀氨酰胺、100 U·mL-1青黴素以及100 mg·L-1鏈黴素），細胞於5% CO2、相對濕度為90%， 37 ℃條件培養。將對數生長的細胞按6×104個/cm2密度接種於Transwell 培養板上，用於細胞轉運實驗。接種後隔天換液，1周後，每天換液。培養至21 d，以電阻值作指標進行驗證，選取細胞跨膜電阻大於500 Ω·cm2。