斑馬魚在中藥研究中的應用
綜述
作者：田麗莉 朱國福
[摘要] 斑馬魚模型作為一個整體的動物模型，其體積小、高通量、費用低、周期短，且實驗結果可靠，在藥物研究領域廣泛應用。中藥是一個複雜的係統，其有效成分及作用機製是中藥現代化發展的研究熱點之一，隨著先進技術和方法的不斷改進，斑馬魚在中藥研究中的應用逐漸深入，並且已經在活性篩選、毒理、代謝研究等方麵表現出優越性。該文主要介紹了近年來斑馬魚在中藥研究中應用的概況，以期能為中藥基礎研究提供新的思路和方法。
[關鍵詞] 中藥；斑馬魚；活性篩選；毒理；代謝
[Abstract] The zebra fish model， as an integral animal model， features small volume， high throughput， low cost， short cycle and reliable experimental results， thus has been widely used in medical studies. Traditional Chinese medicines （TCM） constitute a complex system， their active ingredients and action mechanisms are among study hotspots in during the development of modern TCMs. Along with the constant improvement of advanced technologies and methods， zebra fishes have been increasingly applied in studies on TCMs and shown advantages in active screening， and toxicity and metabolism studies. In this paper， TCM studies by using zebra fishes in recent years are summarized to provide new ideas and methods for basic studies on TCMs.
[Key words] traditional Chinese medicine （TCM）； zebra fish； active screening； toxicity； metabolism
以實驗魚類進行研究已成為當今藥學研究，特別是藥物篩選的熱門手段[1]。斑馬魚自20世紀70年代受到關注以來，在相關研究領域倍受青睞。2012年10月，國家斑馬魚資源中心在中國科學院水生生物研究所正式掛牌成立；我國現有250多個實驗室利用斑馬魚開展有關科研工作[2]。目前，人類麵臨的健康挑戰主要是非傳染性的慢性病，而中醫藥以其獨特的優勢在機遇和挑戰中前行，21世紀中醫藥的發展具備潛力[3]。隨著斑馬魚模型應用於人類疾病研究的深入，中藥相關的研究也不斷發展。本文在查閱國內外有關文獻的基礎上，主要從活性篩選、毒理、代謝等方麵，對斑馬魚在中藥研究中應用的概況進行綜述。
1 斑馬魚用於中藥活性篩選
目前，高通量篩選已成為新藥研發的熱點之一。斑馬魚模型適合研究中藥複雜成分體係的活性。斑馬魚模型具哺乳動物類似的生理生化特征，且高效、快速、大規模等，已被廣泛用於研究人類疾病和高通量藥物的篩選[4-5]。斑馬魚的胚胎和幼魚作為高通量藥物篩選模型，很好填補了細胞模型和齧齒動物模型過渡的空白。
1.1 抗炎藥物篩選與炎症治療
以斑馬魚模型作為中藥抗炎免疫藥物研究優勢頗多，如：利用轉基因及相關技術，結合活體成像顯微係統，可視化斑馬魚炎症感染模型宿主-病原體的相互作用，動態觀察感染形成過程；使用熒光標記免疫細胞轉基因係，示蹤各種免疫細胞在致病原感染中的免疫反應；使用熒光標記藥物，實時監測藥物在魚體內的吸收代謝及分布等情況[6]。針對已知調節中性粒細胞功能及其壽命的靶點而進行抗炎藥物篩選的研究，證實了斑馬魚在藥物篩選上的有效性[7]。宋春雨等[8]采用創傷感染法構建斑馬魚嗜水氣單胞菌感染模型，研究了苦地膽內酯對嗜水氣單胞菌感染斑馬魚的保護效果，結果顯示一定劑量的苦地膽內酯對嗜水氣單胞菌感染斑馬魚具有保護效果。楊麗玲等[9]采用斑馬魚模型評價甘草酸的抗內毒素作用，結果顯示甘草酸對內毒素引起的幼魚致命性感染有明顯的保護作用，且幼魚存活率與甘草酸的濃度正相關。
1.2 血管生成藥物篩選與抗/促血管治療
Fli1是一個與血管形成密切相關的基因，在血管內皮細胞中均表達；而Tg（Fli1-GFP）轉基因斑馬魚的基因組中插入Fli1-GFP重組基因序列，在Fli1啟動子的調控下，這段基因中的綠色熒光蛋白GFP就會表達，在熒光顯微鏡下所有血管的內皮細胞都發生熒光，可以直接觀察斑馬魚血管的生成情況。因此，Tg轉基因斑馬魚成為一種非常便捷的抗/促血管新生的體內研究模型，斑馬魚血管生成模型是目前兼具整體和快速雙重特性的藥物篩選模型。
1.2.1 抗血管生成研究 良性腫瘤血管生成稀少且生長緩慢，而大多數惡性腫瘤的血管生成密集且生長迅速。腫瘤的抗血管生成治療是腫瘤綜合治療的重要內容之一。斑馬魚模型適用於抗血管生成研究，White等[10]係統的剖析並闡述了斑馬魚用於腫瘤模型研究在目前和今後的重要性。
王思鋒等[11]用斑馬魚模型研究西黃丸對血管生成的作用，結果顯示西黃丸具有抑製斑馬魚胚胎體節間血管生成的活性，與腫瘤細胞模型的研究結論一致。斑馬魚的胚胎可作為整體動物模型應用於中藥抑製血管生成活性的評價。陳錫強等[12]通過進一步研究發現乳香與人工牛黃是西黃丸中具有抑製血管生成作用的主要藥味。
鄭浩江等[13]研究證明靛玉紅具有抑製斑馬魚胚胎體節間血管生成的作用，其機製可能是阻斷了VEGF/VEGFR2信號通路的某個環節。在靛玉紅母體結構改造中，隨著C-3′位肟化以及C-6位溴原子的引入，溶解性明顯改善，其抑製血管生成活性也逐漸增強；利用斑馬魚模型考察靛玉紅及其衍生物抑製血管生成活性及量效關係，可為斑馬魚模型在新藥構效關係研究中的應用提供實驗依據[14]。
楊彬睿等[15]發現甜橙黃酮可以劑量依賴性地抑製斑馬魚胚胎體節間血管的生成，下調血管新生相關基因hras，kdrl和vegfaa的表達；可劑量依賴性抑製VEGF誘導的HUVECs增殖，並誘導HUVECs停滯於細胞周期G0/G1期。
趙洋等[16]發現南蛇藤素及扁蒴藤素對斑馬魚胚胎體節間血管生成有顯著的抑製作用，且與給藥濃度呈正相關；南蛇藤素與扁蒴藤素比較，具有相近的新生血管抑製作用。類似的研究也見於其他文獻[17-18]，給藥濃度與血管生成的抑製作用一般是正相關。
陳錫強等[19]利用斑馬魚模型對中藥提取物進行血管生成抑製活性檢測，從27種提取物中發現了7種（川芎水提物、白芍乙酸乙酯提取物、竹黃水提物、鬼箭羽乙酸乙酯提取物和水提物、乳香水提取物、大青葉乙酸乙酯提取物）具有抑製斑馬魚胚胎體節間血管生成的作用，這種作用與 VEGFR2表達有關。類似的結果也見於其他文獻[20-21]，反映了血管生成中VEGFR2的表達發揮了重要的作用。
He等[22-23]對中藥大黃不同溶劑提取物及大黃主要蒽醌衍生物活性及機製進行了研究，發現在大黃正己烷、乙酸乙酯、正丁醇和水提取部位中乙酸乙酯部位抑製血管作用最強（52%），大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸具有明顯的血管抑製作用；大黃酸抑製血管作用機製主要是通過下調胚胎的Ang-2/Tie2 mRNA 表達及抑製內皮細胞遷移。
Yeh等[24]研究發現當歸揮發油中分離的正丁烯夫內酯能顯著抑製斑馬魚腸下靜脈的生成，且體外能抑製HUVEC細胞周期的進程而引起細胞凋亡並激活P38和ERK12的信號通路。當歸水提物主要表現為促進血管生成，而當歸的揮發油卻有抑製血管生成的作用，這從某種程度上反映了中藥雙向調節的整體作用。
Zhong等[25]研究發現莪術揮發油中呋喃二烯抑製血管生成作用與血管內皮生長因子受體抑製劑SU5416近似。朱亞傑等[26]研究證明紅景天甙可抑製肝癌細胞（W256，H22，Hepa1-6） 的增殖，並能有效抑製斑馬魚胚胎體節間血管生成及抑製HUVEC的生長及遷移，且不顯示明顯的細胞毒性。中藥活性成分的優越性可見一斑。
1.2.2 促血管生成研究 Liu等[27]對中藥地黃水粗提取物不同溶劑萃取部位進行活性篩選， 並對活性部位主要化學成分進行血管藥效學研究，結果顯示活性部位的主要化學成分為咖啡酸，具有明顯促血管生成作用。田麗莉等[28]研究發現莪術醇能使斑馬魚胚胎體節間血管側生出新的血管，使成魚剪尾後血管再生加快；作用機製可能是通過提高VEGFA及VEGFR2基因的表達。李惠玲[29]通過斑馬魚模型實驗，初步證實了麝香保心丸有明顯的促血管生成作用，從另一個層麵闡明了麝香保心丸作為一種冠心病治療藥物具有較高的臨床應用價值。Hu等[30]研究發現黃芪多糖成分對受損的血管新生功能具有較強的修複作用，這一作用與上調flk-1和flt-1 的mRNA表達有關。張哲睿等[31]選擇正常健康轉基因斑馬魚及內皮細胞生長因子受體酪氨酸激酶抑製劑誘導血管損傷2種模型，分別用三七（根）總皂苷和三七花總皂苷幹預處理，結果顯示三七花總皂苷和三七（根）總皂苷均有促血管新生和保護血管的效果，且三七花總皂苷效果更為明顯。
1.3 抗骨質疏鬆活性篩選
斑馬魚骨質疏鬆模型介於單細胞和整體哺乳動物之間，可作為細胞實驗和常規動物實驗評價之間的橋梁；斑馬魚體積小而有完整骨骼，可實現微量成分的在體微板形式的高效評價。
Fleming等[32]用糖皮質激素誘導斑馬魚幼魚骨礦化量減少的斑馬魚骨質疏鬆模型，可在微孔板中進行藥物的在體抗骨質疏鬆活性評價。有研究采用斑馬魚模型證明甘草查爾酮A具有雙向調節作用，可促進骨形成和抑製骨質吸收，有益於骨相關的失調症[33]。王娟等[34]研究顯示淫羊藿苷對斑馬魚牙齒發育期間鈣磷沉積有一定的影響。韋英傑等[35]首次提出基於模式生物斑馬魚創立中藥壯骨效應評價新模型，與經典的在體大鼠骨質疏鬆模型相比，它最大限度地保留了在體動物的完整性，克服了在體動物實驗強度大，耗時長、低靈敏，用樣量大，量微成分不能實現評價等缺陷；與體外成骨和破骨細胞模型相比，實驗條件要求低、成本低，並克服了體外實驗作用環節單一，難以體現在體綜合效應的缺陷。有研究利用潑尼鬆龍誘導的斑馬魚骨質疏鬆模型評價微量淫羊藿苷和朝藿定B抗斑馬魚骨質疏鬆的作用，結果與現有大鼠骨質疏鬆模型和細胞模型報道的結論具一致性，在此基礎上，進一步應用該模型成功評價了作用與機製尚不明確的朝藿定B的抗骨質疏鬆活性[36]。
1.4 神經模型
斑馬魚的整個神經遞質係統包括膽堿能多巴胺能和去甲腎上腺素能通路已經被闡明，相比於其他無脊椎模型生物，斑馬魚出生後3 d就開始發育功能完好的血腦屏障，這些都說明了斑馬魚模型在神經係統疾病研究上的優勢。研究人員相繼發現了斑馬魚在學習、睡眠、藥物成癮及其他神經行為表型與人類相似並且可以定量研究。
王言等[37]對續斷總皂苷對斑馬魚空間認知能力的影響進行了研究， 將斑馬魚放置在不同濃度的續斷總皂苷溶液中，在體實驗結果表明，高劑量的續斷總皂苷可以顯著提高斑馬魚的認知和記憶能力及 Na+-K+-ATP 酶的活力；其作用機製可能是通過提高Na+，K+-ATP酶的活力，加速ATP的分解，提高腦部能量供給有關。王美微等[38]探討穀精草乙醇提取物（EBE）對6-羥基多巴胺在PC12細胞和斑馬魚上引起的神經損傷的保護作用及其機製，結果EBE對6-羥基多巴胺誘導的PC12細胞損傷具有保護作用，能減少6-羥基多巴胺引起的細胞凋亡，並且可以抑製6-羥基多巴胺在斑馬魚上引起的多巴胺神經元減少，其作用機製可能與降低NO的產生和iNOS的表達量有關。Zhang Z J等[39]發現槲皮素可以減輕6-羥基多巴胺誘導的神經元損傷，但是不能恢複已形成的損傷；斑馬魚胚胎受精後3 d內血腦屏障未完全成熟，槲皮素可以迅速分布在腦內發揮神經保護作用，但是當斑馬魚胚胎發育3 d後成熟的血腦屏障結構會阻礙槲皮素進入腦組織無法保護神經元損傷。類似的研究還包括穀精草提取物和益智仁乙醇提取物[40-41]。Richetti等[42]考察槲皮素和蘆丁對東莨菪堿致記憶障礙斑馬魚模型的防治作用。發現槲皮素和蘆丁都可在不影響魚體正常運動的情況下預防由東莨菪堿導致的記憶障礙，提示槲皮素和蘆丁等植物成分可能成為神經係統疾病（如阿爾茨海默症）的治療藥物。這充分顯示了中藥的潛在治療價值。