DNA條形碼技術在常見中藥材蛇類鑒別中的應用
資源與鑒定
作者：黃勇等
[摘要] 中藥材的準確鑒別是中藥材研究、生產和應用至關重要的一步。DNA 條形碼技術以線粒體細胞色素氧化酶Ⅰ亞基（COⅠ）基因序列作為標記，在中藥材鑒別中的應用日益增多。研究應用DNA 條形碼通用引物擴增測序，探討DNA條形碼技術在常見中藥材蛇類（6科15屬19種共109個樣品）鑒別的可行性，采用鄰接法構建該類群分子係統發育樹。結果表明，該片段的G+C平均量為43.9%，低於A+T平均量（56.1%）。基於Kimura 雙參數模型計算，白唇竹葉青、烏梢蛇和赤練蛇的種內平均遺傳距離均大於2%。通過構建係統發育關係後進一步分析發現，白唇竹葉青一樣品鑒別有誤。烏梢蛇中的某些樣品也可能存在鑒別有誤，即原本是灰鼠蛇的可能被錯誤鑒定為烏梢蛇。造成赤練蛇種內遺傳距離差異大的因素需進一步分析。DNA條形碼用於常見中藥材蛇類種間的鑒別是可行的，極大程度地彌補統形態學分類方法的缺陷，值得加大推廣應用和進一步深入研究。
[關鍵詞] COⅠ；遺傳距離；係統分類；烏梢蛇
[Abstract] Identification accuracy of traditional Chinese medicine is crucial for the traditional Chinese medicine research， production and application. DNA barcoding based on the mitochondrial gene coding for cytochrome c oxidase subunitⅠ（COⅠ）， are more and more used for identification of traditional Chinese medicine. Using universal barcoding primers to sequence， we discussed the feasibility of DNA barcoding method for identification commonly-used medicinal snakes （a total of 109 samples belonging to 19 species 15 genera 6 families）. The phylogenetic trees using Neighbor-joining were constructed. The results indicated that the mean content of G+C（46.5%） was lower than that of A+T（53.5%）. As calculated by Kimera-2-parameter model， the mean intraspecies genetic distance of Trimeresurus albolabris， Ptyas dhumnades and Lycodon rufozonatus was greater than 2%. Further phylogenetic relationship results suggested that identification of one sample of T. albolabris was erroneous. The identification of some samples of P. dhumnades was also not correct， namely originally P. korros was identified as P. dhumnades. Factors influence on intraspecific genetic distance difference of L. rufozonatus need to be studied further. Therefore， DNA barcoding for identification of medicinal snakes is feasible， and greatly complements the morphological classification method. It is necessary to further study in identification of traditional Chinese medicine.
[Key words] COⅠ； genetic distance； phylogenetic systematics； Ptyas dhumnades
中藥材之真偽、優劣，關係到臨床用藥之藥效、人民健康與生命安危。當前，由於中醫藥市場在國內外的急劇擴張及自然資源的有限性，對這些資源的保護日益受到社會各界關注。尤其在藥用動物的資源保護和開發利用方麵，解決其真偽鑒別成為提高動物藥材質量和可持續發展的重要課題[1]。眾所周知，中藥材的種類繁多、商品來源複雜、形態多樣如加工後形成的中藥飲片、粉末和中成藥（丸劑、散劑、膏劑、丹劑等）等情況，顯然，若需對這些藥材的真偽進行鑒定，僅靠藥材的基原、性狀、顯微和理化特征等方法則無法進行或最終影響鑒定的準確性以及普及性。近些年，隨著現代分子生物學技術的快速發展，DNA 分子標記（如限製性片段長度多態性、隨機擴增多態性DNA、基因芯片、DNA條形碼）作為另一鑒別手段，在物種鑒定及中藥材鑒定方麵迅速發展。其中，DNA條形碼（DNA barcoding）針對上述中藥材鑒別存在的問題如不同形態（粉末、破碎、殘缺等）均可檢測，並且其鑒定結果客觀、準確度高、快捷、可標準化強、能準確地辨別近緣種等特點而被廣泛應用[2]，如金錢白花蛇[3]、龜甲[4]、海馬[5]、海龍[5]、鱉甲[6]、蛤蚧[7]、蛤殼[8]、麝香[9]、珍珠母[10]等藥材來源及其常見混偽品進行DNA 條形碼鑒別研究，結果正品來源與混偽品能夠明確區分較好的效果。
蛇類是中國傳統醫藥重要組成部分之一，中國現有蛇類241種， 藥用蛇類達70多種[11]。中藥材蛇類一般具有祛風濕，通經絡，熄風止痙，止癢解毒等功效。早在2 000年前的中國醫藥學著作《神農本草經》就記載了部分蛇類產品的藥用功效，明朝李時珍的《本草綱目》記載的藥用蛇類達十餘種[12]，如金環蛇Bungarus fasciatus、銀環蛇B. multicinctus、五步蛇Deinagkistrodon acutus、百花曙蛇Orthriophis moellendorffi、三索頜腔蛇Coelognathus radiatus、中國水蛇Enhydris chinensis、短尾蝮Glyodius brevicaudus、眼鏡蛇Naja naja、眼鏡王蛇Ophiophagus hannah、灰鼠蛇Ptyas kottos、滑鼠蛇P. mucosa和烏梢蛇P. dhumnades等。近年來，由於資源有限，價格昂貴，市售常見的蛇藥材均普遍地存在著偽品和混淆品現象，如非藥用價值的蛇冒充有藥用價值蛇類或中藥材蛇類之間存在混淆等現象，特別是炮製後，除去了頭、鱗、骨，更易混雜，這給臨床用藥的安全及質量和療效帶來潛在危險。
參考《中國藥典》（2010年版）[13]、《動物本草》[14]和《中國藥用動物誌》[15]，本研究通過對常見中藥材蛇類共6科15屬19種的109個樣品的COⅠ基因片段進行比對分析，構建分子係統樹，探討DNA 條形碼用於常見中藥材蛇類鑒定的有效性和可行性。
1 材料和方法
1.1 實驗樣品 本研究選取藥用蛇類6科15屬19種共109樣品，其中烏梢蛇7個標本和3個銀環蛇標本，購自廣西各地藥材市場，其他99個樣本的COⅠ序列來源於GenBank數據庫。采用Sphenodon punctatus（登錄號 NC_004815）和Rena humilis（登錄號 AB079597）為外群[16]，本實驗樣品均用95%乙醇固定，於-20 ℃冰箱保存。
1.2 DNA擴增和測序 總DNA基因組提取按照EZUP柱式基因組DNA抽提試劑盒（動物）（上海生工生物工程有限公司）步驟進行，經電泳檢測，提取的總DNA基因組效果良好。COⅠ序列擴增采用通用引物：LCO1490（5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′）和HC02198 （5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′）[17]。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR 采取50 μL 反應體係： 含DNA 模板1 μL（約240 ng） ， 10 ×Ex PCR buffer（含MgCl2）5 μL， dNTP（2.5 mmol·L-1） 4 μL，正反引物（10 mmol·L -1） 各1 μL，Ex Taq DNA 聚合酶（5 U·μL-1 ） 0.25 μL，雙蒸水37.75 μL。PCR反應參數為： 94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s， 52 ℃ 退火30 s， 72 ℃延伸1 min， 共35個循環；72 ℃最後延伸8 min。PCR 產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用直接單向測序，由上海生工生物工程有限公司完成。