1.3 數據分析 運用BioEdit 7.0.9.0軟件[18]對所獲得的COⅠ序列（包括從GenBank下載）進行多重比對，並輔以人工校對。基於脊椎動物線粒體遺傳密碼子，在MEGA 6.05 軟件[19]把COⅠ序列翻譯為氨基酸，以確認這基因片段是否正確。同時把所得測序結果用NCBI 的Blast 工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi）進行相似性檢索，確認實驗所得序列為目的片段。
Kimura雙參數距離模型（Kimura 2 parameter） [20]被認為是估計低遺傳變異序列差異的最佳替代模型[21]，因此，在MEGA 6.05中，基於Kimura 雙參數距離模型計算種內和種間遺傳距離。線粒體DNA不同區域的進化速率存在差異，因此在構建係統發育樹時需要根據序列進化異質性特點而選擇最優進化模型[22]。以BIC作為模型選擇標準[23]，在jModelTest 2[24]軟件對序列進行最優進化模型選擇。
使用Sphenodon punctatus和Rena humilis做外群，分別采用鄰接法（neighbor-joining， NJ）[25]構建常見中藥材蛇類的分子係統發育樹。NJ法構建進化樹時去除序列間的成對缺失，係統樹各分枝的置信度進行自展檢驗分析（bootstrap analysis），重複抽樣1 000次，最終生成50%合意樹，此法在MEGA 6.05中執行。
2 結果
2.1 序列特征 經同源片段比對並輔以人工校正，最後選取639 bp的COⅠ序列進行分析。所有序列不含插入或缺失以及終止密碼子。A，T，C，G 平均量分別為27.3%，28.8%，27.7%，16.2%，其中C+G平均量為43.9%，低於A+T平均量（56.1%）。這都與脊椎動物線粒體DNA的特點是一致的。第一密碼子位點C+G平均量最高為51.1%，第二密碼子位點C+G平均量居中為42.9%，第三密碼子位點C+G平均量最低為38.2%。在總共639 bp中，含變異位點（variable sites）273個，其中簡約信息位點（parsimony-informative sites）有260個，轉換位點和顛換位點比例為3.13。
2.2 種間及種內的遺傳距離 在MEGA 6.05軟件中應用Kimura雙參數法計算種內和種間的遺傳距離，可以看出，全部19種蛇類的種內K2P遺傳距離平均為2.6%，其中種內平均遺傳距離最大的物種為白唇竹葉青T. albolabris（18.5%），其次是烏梢蛇P. dhumnades（9.2%），赤練蛇L.rufozonatus（2.3%），這些物種的種內平均遺傳距離均已超Hebert 等[2]所推薦的物種鑒定最小種間遺傳距離2%。三索頜腔蛇C. radiatus和眼鏡蛇N. naja種間的遺傳距離最大，達23.7%，最小的是烙鐵頭P. mucrosquamatus和白唇竹葉青T. albolabris種間平均遺傳距離是9.3%。
2.3 係統發育樹 基於COⅠ序列，采用鄰接法（NJ）方法構建19種的109個常見中藥材樣品的係統發育樹，可以看出分成兩大支，水蛇科Homalopsidae為一支，剩下其他5科（蟒科Pythonidae、眼鏡蛇科Elapidae、遊蛇科Colubridae、水遊蛇科Natricidae和蝰蛇科Viperidae）並為一支，節點支持率為98%。在支係Ⅰ中，蟒科Pythonidae的所有緬甸蟒P. bivittatus的樣品構成單係，節點支持率為100%。蝰蛇科Viperidae（包括尖吻蝮屬Deinagkistrodon、竹葉青屬Trimeresurus、原矛頭蝮屬Protobothrops）構成單係，節點支持率為86%，其中所有尖吻蝮屬的樣品均構成單係，節點支持率為100%，然而竹葉青屬的樣品沒有聚成單係，其中1個樣品（登錄號 JX233621）和原矛頭蝮P. mucrosquamatus聚成單係，節點支持率為100%。遊蛇科Colubridae的各個屬（包括曙蛇屬Orthriophis、鼠蛇屬Ptyas、鏈蛇屬Lycodon、黃脊遊蛇屬Hierophis和頜腔蛇屬Coelognathus）沒有各自構成單係。所有百花曙蛇O. moellendorffi的樣品聚為單係，節點支持率為100%。鼠蛇屬的物種形成單係，節點支持率為58%，然而，所有烏梢蛇P. dhumnades的樣品沒有構成單係，而是形成兩支。灰鼠蛇P. korros和其中烏梢蛇一支（Clade A1）聚在一起，節點支持率達100%。所有滑鼠蛇P. mucosa的樣品聚為單係，節點支持率為100%。黃脊遊蛇H. spinalis和赤鏈蛇L. rufozonatus的親緣關係近，節點支持率為62%。所有鏈蛇屬的樣品構成單係，節點支持率為100%。水遊蛇科Natricidae的所有虎斑頸槽蛇R. tigrinus的樣品形成為單係，節點支持率為100%。眼鏡蛇科Elapidae的各個屬包括環蛇屬Bungarus、眼鏡蛇屬Naja和眼鏡王蛇屬Ophiophagus沒有各自構成單係。銀環蛇B. multicinctus和金環蛇B. fasciatus為姐妹群，節點支持率為73%，眼鏡王蛇O. hannah自成一支，支持率為100%。在支係Ⅱ中，水蛇科中的中國沼蛇M. chinensis和鉛色水蛇E. plumbea分別構成單係，互為姐妹群，節點支持率為98%。
3 討論
中藥材的準確鑒定是中藥材研究、生產和應用至關重要的一步。隨著影響藥材質量因素的多樣化，通常以動植物的形態和顯微特征等作為鑒定指標的傳統方法已不能滿足實際需要[26]。隨著分子生物學技術的發展，大量的事實已證明，自從DNA條形碼技術被提出以來，該技術在中藥材混偽品鑒定、中藥質量評價與質量控製等領域發揮的作用越來越大，是傳統以形態、顯微等特征的鑒定方法強有力補充[27]。本研究常見的中藥材蛇類（6科15屬19種）之間的DNA條形碼存在不同程度的差異，種間沒有共享單倍型，即沒有共享序列，並且種間的遺傳距離差異比種內的遺傳距離大得多。這說明DNA條形碼在常見中藥材蛇類間檢驗具有有效性，即DNA條形碼在實際應用中可作為常見中藥材蛇類的鑒定手段。
Hebert 等[2]推薦物種鑒定最小種間遺傳距離為2%。線粒體基因種內遺傳距離大部分都小於1%，隻有極少數情況下會大於2%，而後者的出現，即造成種內遺傳距離大於2%的原因可能是物種鑒定有問題或存在種間雜交等因素引起的[28] 。在本研究中，白唇竹葉青T. albolabris、烏梢蛇P. dhumnades、赤鏈蛇L. rufozonatus的種內平均遺傳距離均大於2%。Heber 等[2]提出如果種間平均遺傳距離要高於種內平均遺傳距離的10倍，即10倍準則，則可以假定它們為不同物種。本研究中種內平均遺傳距離為0～18.5%，種間遺傳距離為9.3%～26.2%，屬間遺傳距離為11.4%～25.9%，科間遺傳距離為19.9%～23.8%。最大值（最大種內差異）為18.5%，出現在白唇竹葉青個體間；種間平均遺傳距離最小值（最小種間差異）為9.3%，出現在原矛頭蝮和白唇竹葉青之間。
通過構建係統發育關係後進一步分析發現，白唇竹葉青的2個樣本沒有聚為單係，白唇竹葉青其中一樣品（登錄號 JX233621）和原矛頭蝮聚成單係，支持率為100%，兩者種間平均遺傳距離為0.2%，由此可知，白唇竹葉青（登錄號 JX233621）可能是鑒別有誤。在烏梢蛇分支內分化成2個分支（Clade A，Clade B），節點支持率非常高，均為100%。種內（假設2個分支均為同一個種）的平均遺傳距離為9.6%，而2支間的平均遺傳距離為16.2%。雖然種間平均遺傳距離與種內平均遺傳距離並不符合DNA條形碼的10倍準則，但是可以看到，在Clade A1中，烏梢蛇和灰鼠蛇聚在一起，兩者並不能很好地區分。再進一步分析發現，在Clade A的種內平均遺傳距離為2.3%，種間平均遺傳距離為2.2%；在Clade A1中（若假設為一個種），種內平均遺傳距離為0.8%，而種間平均遺傳距離（若假設為2個種）為0.9%。可見，很有可能Clade A中的原來是灰鼠蛇的被錯誤鑒定為烏梢蛇。值得注意的是，滑鼠蛇、烏梢蛇和灰鼠蛇聚為一單係，節點支持率為58%，這意味著它們之間沒有能夠很好地分開。在運用貝葉斯法構建它們之間的係統發育樹時（數據在這裏沒有顯示），滑鼠蛇能夠和烏梢蛇和灰鼠蛇分開（後驗概率為0.84），然而烏梢蛇和灰鼠蛇仍然聚在一起，不能很好地分開。Cao 等[28]對烏梢蛇及其混淆品的DNA條形碼分析後也發現，烏梢蛇容易和灰鼠蛇在使用過程中容易出現鑒別錯誤。在赤練蛇分支分化成2個分支（Clade C，Clade D），節點支持率均為100%，Clade C 的平均遺傳距離是0.4%，Clade D的平均遺傳距離是0.6%，兩支間的平均遺傳距離是3.5%，然而這不符合10倍規則。在將來研究中，造成赤練蛇種內遺傳距離差異大的因素可深入分析。