四物湯對Caco—2細胞P—糖蛋白功能和表達的影響
藥理
作者：蔣逸等
[摘要] 研究四物湯對Caco-2細胞P-糖蛋白（P-gp）功能和表達的影響。采用實時定量聚合酶鏈式反應（Q-PCR）分析Caco-2細胞上MDR1基因mRNA的表達量；采用流式細胞儀檢測經四物湯水煎液處理後Caco-2細胞對羅丹明123攝取量的影響，以評價P-gp的外排功能；采用Western blotting法檢測四物湯水煎液對Caco-2細胞P-gp蛋白表達量的影響。與空白對照組比較，四物湯水煎液3.3，5.0，10.0 g·L-1孵育Caco-2細胞24，48，72 h對MDR1基因mRNA的表達量具有上調作用，表明四物湯水煎液對MDR1具有誘導作用；四物湯水煎液作用於Caco-2細胞48 h後，細胞內羅丹明123的攝取量分別減弱了16.6%，22.1%（P
[關鍵詞] 四物湯；P-gp；MDR1；Caco-2細胞；羅丹明123
[Abstract] To study the effect of Siwu decoction on the function and expression of P-glycoprotein （P-gp） in Caco-2 cells. The Real-time quantitative poly-merase chain reaction （Q-PCR） was used to analyze the mRNA expression of MDR1 gene in Caco-2 cells. Flow cytometer was used to study the effect of Siwu decoction on the uptake of Rhodamine 123 in Caco-2 cells， in order to evaluate the efflux function of P-gp. Western blotting method was used to detect the effect of Siwu decoction on the P-gp protein expression of Caco-2 cells. Compared with the blank control group， after Caco-2 incubation with Siwu decoction at concentrations of 3.3， 5.0， 10.0 g·L-1 for 24， 48， 72 h， the mRNA expression of MDR1 was up-regulated， suggesting the effect of Siwu decoction in inducing the expression of MDR1. After the administration with Siwu decoction in Caco-2 cells for 48 h， the uptake of Rhodamine 123 in Caco-2 cells decreased by respectively 16.6%， 22.1%（P
[Key words] Siwu decoction； P-gp； MDR1； Caco-2； Rhodamin 123
P-糖蛋白（p-glycoprotein，P-gp） 是一個由約1 280個氨基酸組成的能量（ATP）依賴性轉運蛋白，分布在人體很多正常組織中，如腸道、肝、腎以及血腦屏障胎盤屏障的上皮細胞，它能將P-gp底物藥物逆向轉運出細胞，降低藥物在細胞內的濃度，減少藥物對細胞組織的損傷，此外，腸黏膜P-gp能夠將底物藥物由腸上皮細胞逆轉運藥物到腸腔中從而降低了藥物在腸道的吸收，影響藥物的口服生物利用度[1-2]。
四物湯首見於宋代《太平惠民和劑局方》，由熟地黃、當歸、白芍、川芎組成，為經典的補血之基礎方，由四物湯衍生的桃紅四物湯[3]、人參四物湯[4]和參芪四物湯[5]等，在現在臨床上發揮著重要的作用；現代研究表明，四物湯在免疫、血液、心血管、抗放和對抗化學藥物的毒性都有很好的調節作用[6]。根據文獻報道，P-gp抑製劑能夠改善芍藥苷的體外吸收[7]；川芎嗪受到P-gp的外排作用，並對P-gp的表達有抑製作用[8-9]，阿魏酸對P-gp具有誘導作用[10]等。上述化合物在四物湯中為治療血虛證的重要活性化合物，同時它們都受到P-gp的調節作用，並作為一個整體被吸收、代謝、分布、發揮療效；查閱文獻發現四物湯在轉運體中發揮的作用並沒有相關報道，本實驗立足四物湯對P-gp轉運體功能和表達的影響，采用人類結腸癌細胞係Caco-2細胞模型，研究了四物湯對P-gp的綜合調節作用，為四物湯及其衍生方的臨床應用提供參考依據。
1 材料
1.1 細胞 Caco-2細胞購買於中國協和醫科大學基礎醫學細胞中心，實驗室用的細胞代數為40～60代。
1.2 試劑與藥品 MEM培養基、胎牛血清（FBS）、青黴素和鏈黴素、非必須氨基酸（NEAA）（Hyclone）；0.25%胰蛋白酶-EDTA、L-穀氨酰胺、羅丹明-123（Sigma公司）；MTS試劑盒（Promega公司）；四物湯由熟地黃、當歸、白芍、川芎組成，全部藥物均購自安徽亳州同仁堂中藥廠（由軍事醫學科學院二所九室馬百平研究員鑒定）；鹽酸普萘洛爾、利福平（中國食品藥品檢定研究院）；MDR1，GAPDH引物（Invitrogen公司）；P-gp單抗（Thermo公司）；HRP標記山羊抗鼠lgG （康為世紀有限公司）；QPCR試劑盒（ABI）。
1.3 儀器 流式細胞儀（美國Becton-Dickinson FACS caliber 公司）；Western blotting電泳儀、濕轉膜儀（美國Bio-Rad公司）；PVDF膜（美國Millpore公司）；StepOnePlus Real-time PCR係統（Applied Biosystems）；CO2培養箱（SANYO MCO20-AIC）；ChemiScope Mini化學發光成像係統（上海勤翔科學儀器有限公司）。