2 方法
2.1 供試樣品的製備 四物湯水煎液按《太平惠民和劑局方》規定的劑量稱取組成，熟地黃15 g，當歸10 g，白芍10 g，川芎6 g，共計41 g。加入適量的蒸餾水，浸泡1 h，按1∶8倍體積比加入蒸餾水，水煎微沸1 h，6層紗布過濾，藥渣再加入5倍體積的蒸餾水，水煎微沸30 min，過濾，合並2次濾液，抽濾後旋轉蒸發濃縮成100%藥液（即每1 mL藥液含生藥1 g）。
2.2 細胞培養 Caco-2細胞複蘇後以2×105 個/mL密度接種於25 cm2的細胞培養瓶中，加入5 mL含10%FBS，1%穀氨酰胺，1%非必需氨基酸，0.1 U·L-1青黴素-鏈黴素雙抗的不完全MEM培養基。細胞在37 ℃，5%CO2的培養箱中培養，隔天換液，待細胞生長至80%～90%時用0.25%胰酶消化並傳代，選取對數生長期的Caco-2細胞用於實驗。
2.3 藥液安全濃度的考察 使用MTS試劑盒檢測四物湯水煎液給藥24，48，72 h後Caco-2細胞的存活率。將細胞密度為2×104個/cm2接種到96孔板中，每孔200 μL，於37 ℃，5%CO2細胞培養箱中培養24 h後，小心吸盡培養液，加入配置不同濃度的四物湯水煎藥液（含生藥質量濃度為0.625，1.25，2.5，5，10，20 g·L-1）200 μL，空白培基為對照組，每組設置6個複孔，在37 ℃，5%CO2細胞培養箱中分別孵育24，48，72 h後，每孔加入8 μL MTS，在細胞培養箱中繼續孵育3 h，然後在多功能酶標儀檢測490 nm處的吸光度（A）。按下列公式計算細胞的相對存活率=（A實驗組-A溶劑對照組）/（A空白對照組-A溶劑對照組）×100%。
2.4 熒光定量PCR檢測MDR1基因的表達 將對數生長期Caco-2細胞分為四物湯水煎液（SWT）不同劑量組（3.3，5.0，10.0 g·L-1）、維拉帕米（Ver，100 μmol·L-1）、利福平（Rif，20 μmol·L-1）陽性對照組、空白對照組（細胞培養基）。受試藥分別作用於Caco-2細胞24，48，72 h後收集細胞。利用Trizol試劑提取細胞總RNA。紫外分光光度計法測定RNA濃度，測定吸光度A260/A280的比值，測定值在1.8～2.0，說明製備的總RNA 較為純淨。以2 μg RNA 為模板，加入到20 μL RT反應體係中，按照反轉錄試劑盒操作製備cDNA，Q-PCR具體操作參照說明書進行，熒光實時定量PCR擴增的循環條件為95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環。以GAPDH作為內參基因，進行PCR擴增的實時定量分析。mRNA表達水平采用比較閾值法進行定量分析[11]。引物特異性由BLAST評價，溶解曲線檢測，表明引物特異性強。
2.5 流式細胞儀檢測Caco-2細胞P-gp外排功能 給藥分組與2.4項相同。分別於37 ℃，5%CO2培養箱中用含藥培養基中培養1，48 h，PBS洗2次，棄上清，用胰酶消化，收集細胞轉入1.5 mL EP管中，4 ℃下2 500 r·min-1離心5 min，棄上清，PBS洗2次，離心棄上清。每管加入羅丹明123（終濃度為10 μmol·L-1），重懸後在37 ℃，5%CO2培養箱中培養60 min，置冰上終止作用，4 ℃下2 500 r·min-1離心5 min，棄上清，用預冷的PBS洗2次，離心棄上清。加PBS 300 μL輕輕吹打，製成單個細胞懸液。在激發波長為466 nm、發射波長為535 nm條件下選擇FITC通道測定2萬個細胞，收集535 nm處的羅丹明123熒光進行分析，分析時除去細胞碎片和細胞團塊對測定的幹擾，實驗重複3次。按下列公式計算羅丹明123的相對熒光強度=A實驗組/A空白對照組×100%。
2.6 Western blotting法檢測P-gp的表達 給藥方案與2.4項相同，加藥後在37 ℃，5%CO2培養箱培養48 h，用PBS洗2次，棄上清，用裂解液RIPA裂解細胞，提取總蛋白，按試劑盒方法操作，繪製標準曲線並計算各樣品中蛋白的量。SDS-PAGE蛋白質電泳，每個樣品取含蛋白60 μg的體積，進行電泳，轉膜，5%BSA封閉1 h，anti-P-gp倉鼠單抗（一抗）孵育過夜，TBST洗滌3次，辣根酶標記的山羊抗小鼠IgG（二抗）孵育1 h，TBST洗滌3次，使用ECL試劑盒至PVDF膜上顯出清晰的條帶，用ChemiScope Mini係統成像。
2.7 統計分析 統計用GraphPad 5.0 統計學軟件處理，用±s表示，組間差異采用t檢驗。
3 結果
3.1 四物湯水煎液安全濃度的考察 四物湯水煎液在相當於含生藥質量濃度為0.625～10 g·L-1相對存活率大於90%，表明藥液在0.625～10 g·L-1為安全濃度，所以受試藥液質量濃度在0.625～10 g·L-1考慮。
3.2 對Caco-2細胞MDR1基因的影響 本實驗考查了3個不同時間點四物湯水煎液對MDR1基因的影響，與對照組比較，3個時間點中維拉帕米和利福平陽性對照組具有統計學意義（P
3.3 對Caco-2細胞P-gp外排功能的影響 與對照組相比，四物湯水煎液3.3，5.0，10.0 g·L-1作用於Caco-2細胞1 h後，胞內羅丹明123的熒光強度影響不大，無統計學意義，表明四物湯水煎液在短時間內對Caco-2細胞P-gp的功能活性沒有影響；3個不同濃度的四物湯水煎液作用於Caco-2細胞48 h後，細胞內羅丹明123的熒光強度分別減弱了16.6%，22.1%（P