複方黃連膠囊對早期糖尿病腎病大鼠腎組織TGF—β1/BMP—7表達失衡及其Smad信號通路的調控作用
藥理
作者：劉聖等
[摘要] 目的：研究複方黃連膠囊（CRCC）對糖尿病腎病（DN）大鼠腎組織TGF-β1/BMP-7表達失衡及其Smad信號通路的調控作用，探討CRCC對DN大鼠早期腎損傷的作用及其可能機製。方法：以鏈脲佐菌素（STZ）複製早期DN大鼠模型，動物分為正常組、模型組、消渴丸組（0.8 g·kg-1）、依那普利組（1 mg·kg-1）與CRCC 低、中、高劑量組（生藥含量分別為1.09，2.18，4.36 g·kg-1），灌胃給藥，每天1次，5周後生化指標檢測空腹血糖（FBG）、尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、胰島素（Ins）、24 h尿蛋白（24 h Upro）及24 h 尿微量白蛋白（24 h UmAlb）；光鏡觀察腎組織形態學的改變；免疫組化法檢測腎組織TGF-β1，BMP-7，Smad2/3，Smad1/5及Smad7蛋白表達；逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測腎組織TGF-β1和BMP-7 mRNA表達。結果：與模型組比較，各CRCC治療組均不同程度降低了DN大鼠FBG，BUN，Scr，24 h Upro 和24 h UmAlb水平，改善腎組織病理形態學異常，TGF-β1與Smad2/3蛋白表達減少，BMP-7，Smad1/5與Smad7蛋白表達增加，TGF-β1 mRNA表達減少，但BMP-7 mRNA表達未增加。結論：CRCC可改善早期DN大鼠腎功能病變，延緩DN慢性病理進展，其機製可能與通過Smad信號通路調控DN腎組織TGF-β1/BMP-7表達失衡有關。
[關鍵詞] 複方黃連膠囊；糖尿病腎病；TGF-β1；BMP-7；Smad信號通路
[Abstract] Objective： To investigate the effect of compound Coptidis Rhizoma capsule（CCRC） on unbalanced expression of renal tissue TGF-β1/BMP-7 and Smad signaling pathway in rats with early diabetic nephropathy（DN），and discuss CCRC′s effect on DN rats with early diabetic nephropathy and its possible mechanism. Method： DN model rats were established by injecting streptozotocin（STZ）. The rats were randomly divided into seven groups： the normal group， the model group， the enalapril treatment group， the xiaoke pill treatment group and three CRCC treatment groups. They were orally administered once a day for five weeks. The fasting blood glucose（FBG），blood urea nitrogen （BUN），serum creatinine （Scr）， insulin（Ins）， 24 h urinary protein （24 h Upro） and 24 h urinary microalbumin （24 h UmAlb） were tested. The pathological changes in renal tissues were examined by optical microscopy. Immunohistochemical measures were used to detect the expressions of TGF-β1，BMP-7，Smad2/3，Smad1/5，and Smad7 protein，and RT-PCR was used to detect TGF-β1 mRNA and BMP-7 mRNA in renal tissues. Result： Compared with model group， BUN， Scr， Ins， 24 h Upro and 24 h UmAlb levels decreased at different degrees in CCRC treatment groups； the abnormal pathomorphology in renal tissue was improved； immunohistochemistry results showed that the expression of TGF-β1 and Smad2/3 were reduced， while the expression of BMP-7，Smad1/5 and Smad7 increased in CRCC treatment groups； the expression of TGF-β1 mRNA were reduced， but the expression of BMP-7 mRNA had no obvious change in CRCC treatment groups. Conclusion： CRCC can improve the early renal function， delay the progression of chronic renal pathology and maintain the dynamic balance of TGF-β1/BMP-7 expression in renal tissues of DN rats. The mechanism may be related to down-regulation of renal TGF-β1 and up-regulation of BMP-7 through Smad signaling pathway.
[Key words] CRCC； diabetic nephropathy； TGF-β1； BMP-7； Smad signaling pathway
糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見而且嚴重的微血管並發症，早期腎病理表現為腎小球係膜細胞增生、基底膜增厚、腎小管上皮細胞轉分化（epithelial-myofibroblast transition，EMT）、足細胞損傷、細胞外基質（extracellular matrixc，ECM）進行性積聚，終期將導致腎小球硬化、腎小管萎縮和間質纖維化。轉化生長因子β1（transforming growth factor-beta1，TGF-β1）是DN腎病變的關鍵性致病因子，具有促進腎小球肥大，刺激係膜區ECM積聚，導致腎小球硬化和腎間質纖維化作用[1-3]。骨形態發生蛋白-7（bone morphogenetic protein-7，BMP-7）是TGF-β超家族成員之一，具有維持腎功能和組織結構作用，是一個重要的腎髒保護細胞因子[4]。BMP-7能通過抑製EMT過程，抑製腎小管上皮細胞Ⅰ-型膠原（type Ⅰ collagen，Ⅰ-Co）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、E-鈣粘素（E-cadherin）、纖維粘連蛋白（fibronectin，FN）和結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）的表達，並逆轉TGF-β1誘導的EMT，EMT的逆轉使腎小管的動態平衡恢複和腎功能改善[5]。DN患者以腎小球BMP-7表達降低和足細胞數量及分化減少為特征，並伴隨CTGF過分表達和TGF-β1表達增強，BMP-7能逆轉糖尿病腎病造成的腎髒肥大，改善腎小球濾過率，減少足細胞的丟失[6]。因此，維持腎組織TGF-β1與BMP-7動態平衡，可能成為延緩DN進展新的策略。複方黃連膠囊（compound Coptidis Rhizoma capsule，CCRC，皖藥製字Z20110001）前期研究，可以降低鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導DN大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，Scr）和24 h尿蛋白（24 h urinary protein，24 h Upro）水平，降低腎組織TGF-β1和Ⅳ-型膠原（type Ⅳ collagen，Ⅳ-Co）蛋白表達，改善腎組織病理改變和超微結構病變[7-8]。本次實驗進一步觀察CCRC對STZ誘導DN大鼠腎組織TGF-β1及其信號傳導蛋白Smad2/3、抑製性蛋白Smad7和BMP-7及其信號傳導蛋白Smad1/5表達的影響，以及其對TGF-β1/BMP-7 mRNA表達的影響，探討CRCC對DN大鼠腎組織TGF-β1/BMP-7表達失衡及其通過Smad信號通路的調控作用。
1 材料
1.1 動物 SD雄性大鼠，體重200～250 g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供，動物使用合格證號SCXK（皖）2005-001。
1.2 藥品與試劑 CCRC（相當於生藥7 g·g-1，含鹽酸小檗堿11.34%，安徽省立醫院，批號20090612） 處方由黃連Coptis chinensis Franch、葛根 Pueraria lobata （Willd.）Ohwi.、麥冬 Ophiopogon japonicus （L. f .） Ker Gawl.、枇杷葉 Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl.組成；消渴丸（廣州中一藥業有限公司，批號P01010），用前研磨，以0.5%羧甲基纖維鈉（CMC-Na）配製成混懸液；依那普利（濟南利民製藥有限公司，批號1001121），用前研磨，以0.5%CMC-Na配製成混懸液；CMC-Na（湖南爾康製藥有限公司，批號20090701）；枸櫞酸和枸櫞酸鈉（台山市新寧製藥有限公司，批號分別為20080601與20091203）；STZ（Sigma公司，批號S-0130）；葡萄糖、尿素氮測定試劑盒（日本和光純藥工業株式會社，批號分別為EH578，EG963）；肌酐、尿蛋白液體試劑盒[德賽診斷係統（上海）有限公司，批號分別為60971014/1，60065769]；尿微量白蛋白液體試劑盒（濰坊三維生物工程集團有限公司，批號110201）；胰島素放射免疫分析藥盒（天津市協和醫藥科技有限公司，批號201011）；兔抗大鼠BMP-7（批號BS-2242R），TGF-β1（批號BS-0103R），Smad2/3（批號BS-0718R），Smad1/5（批號BS-0538R）及 Smad7（批號BS-0566R）單克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；通用型SP 免疫組化染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號HK3400805）；Trizol（美國Invitrogen公司，批號51512101）；逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒（美國MBI Fermentas公司，批號00066575）；引物合成（上海生工生物工程技術服務有限公司）。