1.3 儀器 7600型全自動生化分析儀（日本日立）；LKB-NOVA型超薄切片機（瑞典LKB）； BX51F32H01型光學顯微鏡（日本Olympus）；170-9703型PCR擴增儀（美國Bio-Rad公司）；DYY-8C型中壓電泳儀（北京市六一儀器廠）；DK-8D型電熱恒溫水槽（上海躍進醫療器械廠）；Tanon GIS-2016凝膠圖像處理係統（上海天能科技有限公司）。
2 方法
2.1 動物模型複製、分組及給藥 大鼠適應性飼養1周後，禁食不禁水12 h，於左下腹一次性注射STZ 50 mg·kg-1 （臨用前溶解於0.1 mol·L-1枸櫞酸緩衝液，pH 4.4），72 h後大鼠尾端采血測定FBG，選擇FBG為13.8～30 mmol·L-1者進行實驗[9]。模型大鼠72隻，隨機分為6組：模型組、依那普利組（1 mg·kg-1）、消渴丸組（0.8 g·kg-1）與CRCC低、中、高劑量（生藥分別為1.09，2.18，4.36 g·kg-1）組，每組12隻，另設正常組10隻，共7組。動物除模型組及正常組ig給予0.5%CMC-Na，其餘各組ig給予相應藥物，每天1次，連續給藥35 d。實驗過程中死亡動物剔除，不予統計。
2.2 標本收集 實驗35 d時，提前2 d，置大鼠於代謝籠中，收集24 h尿液，3 000 r·min-1離心15 min，取上清液。末次給藥後，動物禁食不禁水12 h，水合氯醛麻醉，打開腹腔，腹主動脈取血，3 000 r·min-1離心15 min，取血清；切取左側腎髒，去除包膜，稱重，每組選取3隻大鼠切取左腎皮質，經10%中性甲醛固定待作病理形態學觀察和免疫組化檢測；右腎稱重後立即置於-80 ℃冷凍待做RT-PCR。
2.3 生化指標測定 應用7600型全自動生化分析儀測定血清FBG，BUN，Scr，24 h Upro和24 h尿液微量白蛋白（24 h urinary microcontent albumin，24 h UmAlb）；放射免疫法測定血清胰島素（insulin， Ins）。
2.4 腎組織病理形態學觀察 腎組織經10%中性甲醛固定，常規脫水、透明、包埋、製成厚3 μm切片，行蘇木素伊紅（haematoxylin eosin stain，HE）染色，用於顯示腎小球係膜細胞增生與毛細血管開放性。行馬鬆三色（Masson）染色，用於顯示腎小球係膜區和腎小管膠原增生情況。
2.5 免疫組化染色 腎組織石蠟切片使用免疫組織化學SP法（過氧化物酶標記的鏈黴卵白素法）檢測，TGF-β1，BMP-7，Smad2/3，Smad1/5及 Smad7蛋白一抗濃度均為1∶200，DAB顯色劑，蘇木素輕度複染，脫水、二甲苯透明、樹脂封片。每張切片從腎皮質外側向內，自上而下隨機取10個高倍（×400）視野，觀察陽性細胞分布情況，並用Image-proplus 6.0圖像分析軟件進行半定量分析，TGF-β1，BMP-7，Smad2/3，Smad1/5及 Smad7蛋白表達以平均吸光度（累積吸光度/測量麵積）表示。
2.6 RT-PCR檢測TGF-β1 mRNA和BMP-7 mRNA 取大鼠右側腎髒腎皮質200 mg，按照Trizol 試劑說明書提取總RNA，鑒定 RNA 的純度及完整性（測得所提取的RNA A260/A280範圍1.6～2.0，且凝膠電泳顯示18S和28S條帶清晰，說明純度良好）。參照逆轉錄試劑盒操作規程合成25 μL cDNA，PCR擴增TGF-β1和BMP-7基因片段。TGF-β1基因的PCR擴增反應條件：94 ℃變性3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 30 s，擴增35個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。引物序列為TGF-β1上遊5′-AATACGTCAGACTTCGGGAAGCA-3′，下遊5′-GTCAATGTACAGCTGCCGTACACA-3′（498 bp）；內參照β-actin上遊5′-CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGA-3′，下遊5′-AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC-3′（587 bp）。BMP-7 基因的PCR 擴增反應條件：94 ℃ 變性3 min，94 ℃ 30 s，61 ℃ 60 s，72 ℃60 s，35 個循環，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。引物序列為BMP-7 上遊5′-AGACGCCAAAGAACCAAGAG-3′，下遊5′-GCTGTCGTCGAAGTAGAGGA-3′（323 bp）； 內參照GAPDH上遊5′-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3′，下遊5′-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3′（195 bp）。反應後分別取10 μL PCR擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，凝膠成像後應用Bandscan 圖像分析係統分析各條帶積分吸光度，每組標本重複檢測5次，TGF-β1和BMP-7的相對表達量以TGF-β1與β-actin的吸光度比值和BMP-7與GAPDH的吸光度比值表示。
2.7 統計分析 應用SPSS 12.0統計軟件，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），選擇LSD和SNK顯著性檢驗法，所有數據用±s表示，以P
3 結果
3.1 對大鼠FBG，Ins，BUN，Scr，24 h Upro 及24 h UmAlb 水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠FBG，BUN，Scr，24 h Upro 及24 h UmAlb均顯著升高（P
3.2 對大鼠腎組織病理形態學的影響 HE染色顯示，正常組腎小球結構完整，未見腎小球肥大，可見腎小球毛細血管開放，腎小球基底膜、係膜基質未見明顯異常改變，無炎症細胞浸潤；模型組可見腎小球肥大，部分包曼氏囊不規則，腎小球基底膜顯著增厚，腎小球係膜基質明顯增多，係膜區增寬，係膜細胞高度增生，呈彌漫性分布、團塊狀聚集擠壓毛細血管，毛細血管腔狹窄或閉塞，腎小球中的細胞外基質沉積加重，並且組織中有少許炎症細胞浸潤。各治療組也均有不同程度病理改變，但與模型組相比病變均有減輕，腎小球基底膜增厚程度有所改善，腎小球係膜基質增生程度明顯減弱，毛細血管腔狹窄程度明顯減輕，極少量炎症細胞浸潤，Masson染色顯示，模型組染色呈強陽性，亮綠色纖維組織片狀增生，明顯纖維化；各用藥組纖維組織增生少量分布，纖維化程度明顯減弱。
3.6 對大鼠腎組織BMP-7表達的影響 模型組腎小球係膜細胞無或極弱陽性表達；正常組腎小球著色部位廣泛，在腎小球係膜細胞、腎小球囊上皮細胞漿內為強陽性表達，以腎小球係膜細胞為主，呈棕黃色顆粒或塊狀，表達程度顯著高於模型組（P
3.9 對大鼠腎組織BMP-7 mRNA 表達的影響 BMP-7 mRNA在正常組大鼠腎組織表達較強，在模型組表達較正常組明顯減少（P
4 討論
本實驗以STZ誘導實驗大鼠複製糖尿病及其並發症模型，按劑量50 mg·kg-1 ip單次給藥，72 h後，大鼠血糖顯著升高，均在13.8 mmol·L-1以上，在5周實驗過程中，模型大鼠明顯消瘦，精神逐漸萎靡、反應遲鈍，且表現典型的多飲、多食、多尿的糖尿病症狀，後期檢測發現模型大鼠BUN，Scr，24 h Upro 及24 h UmAlb升高，腎髒細胞處於增殖和肥大狀態，腎功能已嚴重減退，提示大鼠DN模型複製成功，並實驗過程中，在不同時間段大鼠均有死亡現象[10]。
依那普利為臨床常用的第2代血管緊張素轉換酶抑製劑，動物實驗表明其對STZ誘導的DN大鼠具有明確的腎髒保護作用[11]。消渴丸是中西藥複方製劑，具有滋腎養陰，益氣生津之功效，用於氣陰兩虛所致的消渴病，症見多飲、多尿、多食、消瘦、體倦乏力、眠差、腰痛。故本實驗選取依那普利和消渴丸作為CRCC對DN大鼠腎髒保護和降糖作用的陽性對照藥。
與模型組比較，CRCC治療組和消渴丸組大鼠FBG明顯降低，各用藥組Ins均明顯升高，這可能與黃連中的小檗堿對STZ誘導的糖尿病大鼠胰島β細胞損害有一定的修複作用和促進胰島β細胞分泌Ins有關[12-13]。24 h尿量和KW/BW呈現不同程度降低，各用藥組均顯著降低DN大鼠BUN水平，且Scr，24 h Upro 及24 h UmAlb均有不同程度的降低。HE及Masson染色表明，模型組腎小球係膜基質明顯增厚，染色呈強陽性，毛細血管腔狹窄或閉塞，少數腎小球出現萎縮、硬化現象，腎小管腫脹、結節狀，腎小球和腎小管及小管間質出現嚴重的纖維化；CRCC治療組腎小球係膜基質增厚減輕，腎小球和腎小管及小管間的纖維組織減少，表明CRCC能明顯抑製腎小球係膜基質增生作用，改善腎小球組織形態學病變程度，這可能與其降血糖作用、抑製腎小球係膜區細胞外基質合成有關。