2 方法
2.1 動物分組與給藥
32隻GK大鼠適應性飼養1周後，測隨機血糖均大於11.1 mmol·L-1全部入選，根據隨機數字表將其分為模型組、牛蒡子苷元低、中、高劑量組各8隻，Wistar大鼠8隻作為正常對照組，共5組。所有GK大鼠均給予高脂飼料，高脂飼料配方為10%豬油，5%蔗糖，2%膽固醇，0.5%膽酸鈉，0.2%丙硫氧嘧啶，1%穀氨酸鈉，剩餘為普通飼料。Wistar大鼠正常飲食。實驗開始同時采用灌胃給藥，牛蒡子苷元低、中、高劑量組分別按12.5，25，50 mg·kg-1體重給藥。16周後GK大鼠高脂飲食的基礎上，灌胃一氧化氮合酶（NOS）抑製劑L-NAME誘導高血壓，10 mg·kg-1·d-1，連續8周，同時繼續給藥。
2.2 觀察指標及檢測方法
2.2.1 大鼠一般狀態 包括精神活動狀態、皮毛色澤、食飲量、體重等情況。
2.2.2 血糖檢測 實驗開始、中期及結束時檢測血糖變化。
2.2.3 血壓檢測 連續給予L-NAME灌胃，8周後無創血壓計檢測尾動脈血壓。
2.2.4 血常規檢測 24周後麻醉腹主動脈取血，EDTAK2抗凝管采血，血液分析儀進行血常規檢測。
2.2.5 胸主動脈VEGF表達檢測 采血後放血處死動物，胸主動脈，固定做病理切片，免疫組化方法檢測VEGF表達。胸主動脈組織形態學觀察，隨機選5 個視野400倍光鏡觀察，根據文獻方法[8]對主動脈內膜病變程度進行評分。具體方法為內膜連續，內皮細胞形態正常，記作“-”；僅有內皮細胞腫脹或內膜不連續，無內膜增厚，記作“+”；內膜增厚，內皮下細胞數增多，記作“”；內膜增厚，內皮下細胞數增多並有脂質沉積，記作“”。同一隻動物不同視野的不同情況，按最嚴重級別計。
對VEGF免疫組化染色切片進行半定量分析，圖片采集使用Canon Utilities係統，圖像分析使用Image Pro Plus 6.0軟件分析係統，以IOD表示VEGF陽性程度。
2.3 數據處理
試驗數據均以±s表示，用ANOVA進行統計學檢驗，組間比較P
3 結果
3.1 一般狀況觀察
與正常組比較，GK大鼠出現皮毛光澤減弱、質地稍亂，體重增長較慢，飲水量較多，尿液較多；與模型組比較，給藥組動物狀態較好，體重增長比模型組低。實驗結束時，模型組動物死亡1隻，其餘組沒有出現動物死亡。
3.2 牛蒡子苷元對GK大鼠血糖的影響
GK大鼠給予高脂飼料後餐後血糖持續升高，至第24周有所下降，實驗結束時血糖變化給藥組與模型組之間沒有明顯差別，表明牛蒡子苷元沒有明顯的降低GK大鼠血糖的作用。
3.3 牛蒡子苷元對GK大鼠血壓的影響
實驗結束時模型組大鼠心率（HR）沒有明顯變化，牛蒡子苷元低、高劑量組HR輕度下降，模型組大鼠收縮壓（SBP）、平均壓（MBP）、舒張壓（DBP）升高明顯，給予牛蒡子苷元大鼠血壓明顯降低（P
3.4 牛蒡子苷元對GK大鼠白細胞總數及分類計數的影響
白細胞是炎性反應的標誌性指標，模型組GK大鼠白細胞總數計數（WBC）及各分類計數均明顯高於正常Wistar大鼠，給予牛蒡子苷元無論是白細胞總數還是分類計數均低於模型組。結果表明牛蒡子苷元對升高的中性粒細胞（PMN）、淋巴細胞（LYM）及單核細胞（MONO）均有抑製作用，同時對升高的嗜酸性粒細胞（EOS）和嗜堿性粒細胞（BASO）也有抑製作用。
3.5 牛蒡子苷元對GK大鼠血小板參數的影響
血小板相關參數可間接反映血小板的功能狀況。血小板損傷與功能異常是糖尿病血管並發症發生、發展的主要危險因素之一。主要表現就是血小板（PLT）破壞增多，生成及釋放加速，生成率低於破壞率，標誌就是PLT數量減少，血小板平均體積（MPV）和血小板分布寬度（PDW）增大，血小板數量減少，而體積增大，故血小板總體積無明顯改變，血小板壓積（PCT）無明顯變化。模型組GK大鼠PLT數量減少，MPV，PDW增大，牛蒡子苷元可以輕度升高PLT，明顯降低MPV，PDW。
3.6 牛蒡子苷元對GK大鼠胸主動脈形態的影響
正常組胸主動脈內膜平坦，內皮細胞扁平，緊貼於平直的內彈力板上，中彈力板與平肌細胞整齊地相間平行排列，內膜光滑整齊；模型組胸主動脈內膜增厚，內膜斷裂不平整，局部脫落，脂質沉積比較明顯，可見多個泡沫細胞，內彈力板呈波浪狀或交織狀排列；牛蒡子苷元低劑量組胸主動脈偶見內膜增厚，內膜增厚處內皮細胞腫脹，內皮下平滑肌細胞輕度增生，脂質沉積不明顯；牛蒡子苷元中劑量主動脈內皮細胞扁平， 內膜平坦， 內膜下平滑肌細胞輕度增生；牛蒡子苷元高劑量組內皮細胞扁平，內膜平坦，中膜平滑，平滑肌細胞及彈力板近似平行相間排列。
經內膜病變程度評分分析，模型組評分明顯高於正常組，差異具有統計學意義，說明模型動物發生明顯內膜病變，牛蒡子苷元給藥各劑量組胸主動脈內膜病變程度與模型組相比明顯降低，差異均有統計學意義。
3.7 牛蒡子苷元對GK大鼠胸主動脈VEGF表達的影響
免疫組化結果顯示正常組胸主動脈VEGF表達很少，模型組在內皮和部分平滑肌細胞呈高表達，各給藥組可檢測到少量VEGF表達，並做圖像分析。
4 討論
糖尿病患者存在多種代謝異常，如長期的高血糖、血脂異常及胰島素抵抗等，這些因素均與大血管並發症密切相關。在細胞水平，糖尿病改變了多種細胞功能，包括內皮細胞、平滑肌細胞等，最終引起血管結構、功能紊亂。VEGF是一種促血管生長因子，由一係列細胞包括腎小球髒層上皮細胞、係膜細胞、T細胞、單核細胞、激活的血小板、心肌細胞、平滑肌細胞以及一些腫瘤細胞產生[9]，VEGF特異性作用於血管內皮細胞，具有增加微靜脈通透性，促進血管生成和維持血管功能等作用，是反應血管內皮通透性和增殖性的指標。糖尿病炎症微環境狀態下缺血、缺氧、糖基化終末產物（AGEs）是刺激血小板活化和VEGF分泌的重要因素[10]，VEGF與炎症細胞共同參與炎症過程[11-12 ]。VEGF 在正常冠狀動脈內皮細胞無表達，在損傷處的內皮細胞呈激活狀態，呈陽性表達[13]，對VEGF 與大血管病變關係的研究發現，合並有糖尿病大血管病變的患者血清VEGF 顯著升高[14]，循環和內皮細胞分泌的VEGF共同在糖尿病大血管病變過程中發揮作用。本研究免疫組化結果顯示模型組胸主動脈VEGF表達明顯升高，牛蒡子苷元各劑量組表達量明顯減少，表明牛蒡子苷元可以抑製VEGF的表達。
2型糖尿病是慢性低度炎症反應的一種，白細胞作為炎性反應的標誌性指標，是糖尿病發生、發展的獨立預警因子[17]。Wolford J K等[16] 研究也發現在印第安人中CRP基因的變異可能在糖尿病易感性方麵起一定作用。近年來研究發現慢性炎症與糖尿病大血管並發症密切相關[15]，T2DM患者的WBC計數與主動脈斑塊厚度呈正相關，並且是內皮依賴性血管舒張功能障礙的獨立危險因素[18]。本研究模型大鼠白細胞總數與分類計數均高於正常Wistar大鼠，而牛蒡子苷元對升高的白細胞具有顯著的降低作用，表明牛蒡子苷元具有顯著的抗炎效果。
研究表明，2 型糖尿病患者PLT減少，MPV，PDW增高[19]。因大體積血小板內部含有更多的糖原、腺嘌呤核苷酸和磷酸鹽，血小板第3因子活躍，所以大體積血小板的聚集能力、代謝和功能均更活躍，使血液處於高凝狀態，容易引起並發症。糖尿病患者病程越長，其發生並發症的機率越高，血小板參數的改變越明顯，已有研究證實血小板參數增加，特別是MPV增加，已認為是多種疾病潛在的心血管並發症發生及病情預後的生物標誌[20]。本研究模型大鼠PLT減少，MPV，PDW增高，與臨床糖尿病患者血小板參數特征相似，牛蒡子苷元可以顯著降低MPV，PDW，表明其可以減少血小板的破壞，減少大體積血小板比例。
高血壓常與糖尿病相伴發生，在我國超過一半的2型糖尿病患者有高血壓病[21]。凡是有糖尿病的高血壓患者都屬於高危或極高危人群，其發生糖尿病血管並發症的速度明顯加快，病死率增加，對於糖尿病合並高血壓患者，降壓治療不僅在於降低血壓，更重要的是減少糖尿病並發症的發生[22]。英國前瞻性糖尿病研究（UKPDS） 證實[23]，良好的血糖控製並不能明顯降低糖尿病大血管合並症的發生率，說明尚有血糖之外的其他原因在糖尿病大血管合並症的發生、發展中起著重要作用。研究顯示糖尿病合並大血管病變的患者存在NO不足[24]，血管平滑肌細胞內的NO可激活可溶性鳥苷酸環化酶（soluble guanylyl eyclase，sGC），升高細胞內環鳥苷酸（cGMP）水平，是NO鬆弛血管平滑肌、抑製血小板聚集、參與神經傳遞的主要信號轉導機製，正常生理濃度的NO是機體所必需的，而NO生成減少可介導動脈硬化閉塞症（arteiriosclerosis obilterans，ASO）的病理生理過程。本研究采用持續給予NOS抑製劑L-NAME抑製血管內皮NO合成，誘導GK大鼠產生高血壓，牛蒡子苷元則可以顯著降低GK大鼠的血壓，而且具有明顯的劑量依賴性。