17—氫—9—去氫穿心蓮內酯體外代謝速率及代謝產物研究
藥代動力學
作者：邵軍等
[摘要] 應用體外大鼠肝微粒體孵育體係，研究喜炎平注射液中主要有效成分17-氫-9-去氫穿心蓮內酯（DHA）的體外代謝速率及代謝產物。將17-氫-9-去氫穿心蓮內酯與加入NADPH的大鼠肝微粒體共同孵育，采用超高效液相色譜-三重四極杆串聯質譜法（UHPLC-MS/MS）測定其剩餘濃度，考察17-氫-9-去氫穿心蓮內酯的肝微粒體代謝速率，並采用超高效液相色譜串聯飛行時間質譜（UPLC-TOF-MSE）對孵育體係中17-氫-9-去氫穿心蓮內酯的代謝產物進行鑒定。研究結果顯示在加入輔酶的大鼠肝微粒體中，17-氫-9-去氫穿心蓮內酯代謝速率較快，其半衰期（t1/2）和肝微粒體中清除率（CL）分別為（19.7±0.5） min和（35.1±0.8） mL·min-1·g-1。高分辨質譜數據結合文獻信息共鑒定孵育體係中17-氫-9-去氫穿心蓮內酯的9個代謝產物，主要為羥基化產物和脫氫產物。鑒定結果為篩選出活性更好的穿心蓮二萜內酯類衍生物提供了一定的依據。
[關鍵詞] 17-氫-9-去氫穿心蓮內酯；肝微粒體；UHPLC-MS/MS；代謝速率；UPLC-TOF-MSE；代謝產物
[Abstract] To investigate the metabolic rate and metabolites of 9-dehydro-17-dehydro-andrographolide， which is the main active ingredient in Xiyanping injection， by using the in vitro rat liver microsome incubation system. 9-dehydro-17-dehydro-andrographolide was incubated together with liver microsome mixed with NADPH. Its metabolic rate was studied by determining its residual concentrations with the UHPLC-MS/MS method； Its metabolites were identified by the UPLC-TOF-MSE method. The results showed that 9-dehydro-17-dehydro-andrographolide was metabolized faster than rat liver microsomes mixed with coenzymes， with t1/2and CL of （19.7±0.5） min and （35.1±0.8） mL·min-1·g-1（protein）， respectively. Based on the high resolution mass spectrum data and information from literatures， altogether nine metabolites of 9-dehydro-17-dehydro-andrographolide were identified in the incubation system， particularly hydroxylated and dehydrogenized products. The results of identification would provide a basis for screening out more active andrographolide derivatives.
[Key words] 9-dehydro-17-dehydro-andrographolide； liver microsome； UHPLC-MS/MS； metabolic rate； UPLC-TOF-MSE； metabolite
喜炎平注射液是以穿心蓮內酯總磺化物（穿心蓮內酯與硫酸發生磺化反應製備）為原料製備而成的中藥注射劑，具有廣譜的抗菌、抗病毒作用，在抗細菌、抗病毒性感染及快速退熱等方麵功效顯著[1]。近年來，關於喜炎平注射液的相關研究，主要集中在其藥理活性和臨床應用等方麵[2-5]，而對於其主要活性成分的研究相對較少。17-氫-9-去氫穿心蓮內酯（9-dehydro-17-hydro-andrographolide，DHA）是喜炎平注射液中的主要活性成分，其結構式。本課題組此前通過微生物抑菌試驗發現DHA有很強的抑菌作用，HPLC測得DHA在喜炎平注射液中的含量約為0.8 g·L-1[6]。其單體注射液尾靜脈注射大鼠後的藥代動力學和組織分布規律表明DHA在血漿和組織分布迅速，半衰期短[7-8]。
肝微粒體孵育實驗是在體外模擬生理條件下，由肝微粒體輔以還原型輔酶進行的生化反應，可排除體內諸多幹擾因素，快速簡便的應用於藥物肝代謝研究。本課題組為進一步了解DHA代謝規律，研究其代謝產物，從而篩選活性更好的穿心蓮二萜內酯類衍生物，采用大鼠肝微粒體體外孵育體係，由超高效液相色譜-三重四極杆串聯質譜法（UHPLC-MS/MS）選擇離子監測（SIM）模式測定孵育體係中DHA的含量，考察DHA體外代謝速率，並采用超高效液相色譜串聯飛行時間質譜（UPLC-TOF-MSE）對孵育體係中DHA的代謝產物進行初步鑒定。
1 材料
1.1 藥品與試劑
17-氫-9-去氫穿心蓮內酯對照品（純度99.5%，江西青峰藥業有限公司），脫水穿心蓮內酯（內標）（批號11854-201308，純度99.7%，中國食品藥品檢定研究院）。乙腈為色譜純（美國Sigma公司），水為Millipore製備的超純水，其他試劑均為分析純。大鼠肝微粒體（質量濃度20 g·L-1，-80 ℃保存，美國BD Gentest公司）；還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）（美國Sigma公司）；磷酸鹽緩衝液（pH 7.4，100 mol·L-1），由100 mol·L-1K2HPO4-100 mol·L-1KH2PO4（80.2∶19.8）混合。
1.2 儀器
1290係列高效液相色譜儀，包括G4220A Bin pump二元高壓泵，G1316C TCC柱溫箱，G4226A全自動進樣器；G4212A二極管陣列檢測器（美國Agilent）；美國Applied Biosystem API 4000三重串聯四極杆質譜儀，Analyst V1.5.2工作站；美國Phenomenex Luna-C18色譜柱（2.0 mm×150 mm，3 μm）；美國Acquity UPLC/Xevo G2 QTof液質聯用儀，MassLynxTM V4.1質譜工作站；美國Waters ACQUITY UPLC BEH-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；德國Sartorius BT 25S，Sartorius BSA124S-CW型電子天平；Vortex XW-80A型旋渦混合器（上海精科）；SORVALL pico高速離心機（德國）；Finnpipette移液槍（美國Thermo）；N-3VAP-112氮吹儀（美國）。
2 方法
2.1 對照品溶液的製備
精密稱取DHA對照品適量，加甲醇配製成質量濃度為100 mg·L-1 DHA儲備液。取適量DHA儲備液加磷酸鹽緩衝液（pH 7.4，100 mol·L-1）稀釋成適當濃度的工作液。精密稱取內標物脫水穿心蓮內酯適量，加甲醇配製成1 mg·L-1內標液。
2.2 定量分析溫孵反應
孵育體係為1 mL磷酸鹽緩衝液（pH 7.4，100 mol·L-1），內含17-氫-9-去氫穿心蓮內酯1 mg·L-1，NADPH 1 mol·L-1和大鼠肝微粒體1 mg·mL-1，37 ℃振蕩水浴孵育。分別於反應0，15，30，45，60 min取出100 μL孵育液，立即加入沉澱劑終止反應。實驗平行設置空白微粒體組、陰性對照組（不加NADPH），每組平行做3份。