2.3 定量分析前處理
取出100 μL孵育液，加入90 μL乙腈和10 μL脫水穿心蓮內酯內標溶液，渦旋1 min，13 000 r·min-1離心5 min，取上清液進UHPLC-MS/MS做定量分析。
2.4 定量分析方法學考察
取空白微粒體，製備係列濃度標準曲線樣品，使孵育體係中17-氫-9-去氫穿心蓮內酯在孵育體係中的質量濃度分別為0.005，0.01，0.05，0.1，0.5，1.0，1.25 mg·L-1（NADPH溶液用磷酸鉀緩衝液替代），按2.3項下方法處理，考察線性關係。相同方法製備使DHA在孵育體係中的有效質量濃度分別為0.01，0.5，1.0 mg·L-1的低、中、高濃度的質控樣品，考察日內、日間精密度和回收率，每個濃度水平均重複6次。
2.5 代謝速率分析
溫孵液所剩的17-氫-9-去氫穿心蓮內酯濃度通過標準曲線計算，反應0 min的濃度作為100%，其餘時間點剩餘濃度與0 min濃度相比得到17-氫-9-去氫穿心蓮內酯剩餘百分比，將各時間點的剩餘百分比的自然對數與相應的孵育時間作圖，經直線回歸求得斜率（k）。半衰期（t1/2，min）=0.693/k，肝微粒體中清除率（CL，mL·min-1·mg-1）=0.693/t1/2（min）×孵育液（mL）/肝微粒體（mg）[9]。
2.6 UHPLC-MS/MS定量分析條件
2.6.1 色譜條件 采用Phenomenex Luna-C18色譜柱（2.0 mm×150 mm，3 μm），以乙腈（A）-水（B）係統梯度洗脫0～10.5 min，33%A；10.5～12.5 min，33%～80%A；12.5～14.0 min，80%A；14.0～16.0 min，80%～33%A；16.0～18.0 min，33%A；流速400 μL·min-1；柱溫40 ℃；進樣量5 μL，紫外檢測波長254 nm。
2.6.2 質譜條件 采用電噴霧負離子模式采集數據，定量分析采用選擇離子監測（SIM）模式，17-氫-9-去氫穿心蓮內酯定量離子[M-H2O-H]-和內標脫水穿心蓮內酯定量離子[M-H]-均為m/z 331.1。氣簾氣（N2）172.4 kPa；離子源GS1（N2）413.7 kPa，GS2（N2）379.2 kPa；源內溫度500 ℃；噴霧電壓-4 500 V；入口電壓（EP）-10 V；出口電壓（CXP）-13 V；分析物與內標物的解簇電壓（DP）均為-64 V。
2.7 定性分析溫孵反應
孵育體係為1 mL磷酸鉀緩衝液（pH 7.4，100 mol·L-1），其中含17-氫-9-去氫穿心蓮內酯20 mg·L-1，NADPH 1 mol·L-1和大鼠肝微粒體1 g·L-1，反應15 min後，立即加入沉澱劑終止反應。實驗平行設置空白微粒體組、陰性對照組（不加NADPH）。
2.8 定性分析前處理
取1 mL孵育液，加入1 mL乙酸乙酯，渦旋混勻，3 000 r·min-1離心10 min，用乙酸乙酯萃取3次，合並乙酸乙酯層，40 ℃水浴下用氮氣吹幹，殘留物用100 μL 50%乙腈溶解，13 000 r·min-1離心5 min後，上清液進超高效液相色譜串聯飛行時間質譜（UPLC-TOF-MSE）分析。
2.9 UPLC-TOF-MSE定性分析條件
2.9.1 色譜條件 采用Waters ACQUITY UPLC BEH-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），以乙腈（A）-水（B）係統梯度洗脫0～2.0 min，10%A；2.0～10 min，10%～50%A；10～12 min，50%A；12～13 min，50%～10%A；流速400 μL·min-1；柱溫40 ℃，進樣量1 μL，PDA檢測波長254 nm。
2.9.2 質譜條件 采用電噴霧負離子模式采集數據，Leucine-enkephalin作校準液，m/z 150～400，采樣間隔為0.3 s，毛細管電壓為3.5 kV，錐孔電壓為35 kV，離子源溫度為150 ℃，脫溶劑溫度為500 ℃，脫溶劑氣體（N2）流速1 000 L·h-1，錐孔氣（N2）流速50 L·h-1，碰撞氣體為氬氣；碰撞低能量為6 eV，碰撞高能量15～45 eV。
3 結果
3.1 UHPLC-MS/MS定量分析方法學驗證
3組樣品色譜圖。結果表明，樣品和內標峰保留時間分別為4.21，9.80 min，未見內源性物質幹擾。17-氫-9-去氫穿心蓮內酯和內標峰麵積比值（Y）對17-氫-9-去氫穿心蓮內酯質量濃度（X）進行線性回歸，得到線性方程為Y=1.24X+0.004 65，R2 = 0.999 6，表明17-氫-9-去氫穿心蓮內酯在0.005～1.25 mg·L-1線性關係良好，定量限為0.005 mg·L-1，低、中、高3個濃度水平的質控樣品（0.01，0.5，1.0 mg·L-1）的日內精密度（RSD，n=6）為2.0%～6.4%，日間精密度（RSD，n=6）為2.9%～4.2%，回收率（n=6）為91.5%～103.6%。方法學驗證結果表明，該方法特異性、靈敏度、精密度和準確度均符合本研究的要求。
3.2 17-氫-9-去氫穿心蓮內酯肝微粒體代謝速率
陰性對照組17-氫-9-去氫穿心蓮內酯不發生轉化，實驗組含NADPH的大鼠肝微粒體孵育體係中，17-氫-9-去氫穿心蓮內酯發生代謝消除，60 min平均轉化率約為87.4%，t1/2=（19.7±0.5） min，CL=（35.1±0.8） mL·min-1·g-1。
A.空白微粒體樣品；B. 空白微粒體中含17-氫-9-去氫穿心蓮內酯（1.0 mg·L-1）和內標物樣品；C. 17-氫-9-去氫穿心蓮內酯（1.0 mg·L-1）孵育15 min後加入內標物樣品。1. 17-氫-9-去氫穿心蓮內酯；2. 內標峰。
3.3 17-氫-9-去氫穿心蓮內酯代謝產物的定性分析
通過PDA對17-氫-9-去氫穿心蓮內酯肝微粒體孵育15 min後的樣品以400～200 nm進行光譜掃描，比較各個波長的色譜圖中各峰的響應值以及基線平穩性，最終設置PDA的檢測波長為254 nm。通過飛行時間質譜對孵育15 min後的樣品和空白微粒體組進行負離子全掃，得到兩者的基峰圖，比對後發現在肝微粒體孵化體係中有10個未知物的色譜 峰（M0～M9）。
利用TOF-MSE在預設定的低碰撞能掃描和高碰撞能掃描之間快速切換從而同時完成2個掃描功能的數據采集，同時獲得10個未知物色譜峰的分子離子及碎片離子信息。根據各色譜峰的精確分子量及二級碎片離子信息，結合穿心蓮二萜內酯類化合物生物轉化的相關文獻，對10個未知物進行了初步鑒定。
組分M4保留時間為6.03 min，分子離子峰為m/z 347，M4的MS2質譜碎片m/z 319為m/z 347五元內酯環丟失-C=O得到，m/z 303為m/z 347五元內酯環丟失-COO得到，m/z 289為m/z 319 4位丟失-CH2O得到，結合文獻[10]，穿心蓮二萜內酯類化合物的3位-OH易被氧化成-C=O，推測M4為原型藥物的3位羥基脫氫產物。
組分M5保留時間為6.17 min，M6保留時間為6.31 min，分子離子峰均為m/z 347，MS2質譜碎片m/z 329為m/z 347丟失一分子H2O得到，而m/z 299為m/z 329 4位丟失-CH2O得到，m/z 281為m/z 299丟失一分子H2O得到。結合文獻[11]，14位羥基位於不飽和內酯羰基的β位，較易失去，因此推測M5為M1的14位脫水產物。M6的MS2質譜碎片與M5完全相同，推測兩者互為羥基異構體。
組分M7保留時間為6.98 min，分子離子峰為m/z 345，MS2質譜碎片m/z 317為m/z 345五元內酯環失去-C=O得到，m/z 301為m/z 345五元內酯環失去-COO得到，與M4裂解方式相似，14位羥基易發生親核取代的氧化反應被氧化成羰基[11]。因此推測為M7為M4 14位羥基脫氫產物。