快速膜乳化法製備熒光探針PLGA納米粒及體內外研究
製劑與炮製
作者：胡濤 石飛燕 潘林梅 朱華旭 郭立瑋
[摘要] 采用快速膜乳化法製備了粒徑均一的聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）納米粒，對其載藥特性和體內分布進行研究。以平均粒徑和PDI為指標，通過單因素實驗考察了膜孔徑、過膜次數、過膜壓力、油水比和聚乙烯醇（PVA）濃度對快速膜乳化法製備納米粒的影響，空白納米粒的優化條件為膜孔徑 1 μm，過膜壓力1 150 kPa，油水比1∶5，PVA質量濃度 20 g·L-1，過膜3次，得到空白納米粒的平均粒徑為332.6 nm，PDI為0.010。采用激光共聚焦技術對其結構特點進行模擬研究，在此基礎之上，將熒光探針包載於納米粒中，采用小動物活體成像技術研究納米粒的體內靶向性。體外模擬研究表明，熒光物質均勻分布於微球內，體內研究表明該粒子具有較好的肝、脾靶向性。
[關鍵詞] 快速膜乳化；聚乳酸-羥基乙酸共聚物；納米粒；工藝優選；熒光探針；靶向
[收稿日期] 2014-09-02
[基金項目] 國家自然科學基金項目（81072749，81303230，30873450，30873449）；江蘇省抗腫瘤驗方研究與產業化工程實驗室開放課題；南京中醫藥大學校級創新團隊項目；江蘇省高校優勢學科建設工程項目
[通信作者] *郭立瑋，E-mail： ；*朱華旭，E-mail
[作者簡介] 胡濤，碩士研究生，E-mail：
熒光探針可用於微球結構識別[1]、藥物運輸過程、細胞屏障跨越方式、藥物釋放過程等的觀測研究，其出現大大促進了藥物新劑型研究的迅速發展[2]。納米粒（nanoparticles，NP）是抗腫瘤藥物及其他藥物的良好載體，尤其是以聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）為材料製備的納米粒，因其良好的生物相容性和生物可降解性而得到了廣泛研究[3]。熒光探針常被包載於微粒給藥係統內，進行給藥係統的體外結構研究、體內示蹤、細胞攝取及轉運機製研究[4-7]，傳統方法製備的微粒其粒徑分布較寬，而較寬的粒徑分布難以獲得良好的靶向性和重複性。快速膜乳化技術利用較高壓力使預乳液通過尺寸均一的微孔膜，使其被破碎成粒徑小、分布更窄的液滴[8-9]，其製備的粒子均一可控。本實驗利用快速膜乳化法製備包載尼羅紅熒光探針的微球，並采用激光共聚焦技術研究微球結構特點。在此基礎之上，用快速膜乳化法製備包載DiR熒光探針納米粒，采用小動物活體成像技術研究納米粒的肝、脾靶向性，以期為肝、脾熒光探針造影成像[10]和體內示蹤提供參考。
1 材料
快速膜乳化裝置；SPG膜（日本SPG Technology公司，親水性，膜長12.5 cm）；DF-101S型智能集熱恒溫加熱磁力攪拌器（河南省予華儀器有限公司）；I-6型冷凍幹燥機（德國Ehrisa公司）；AUW120D型1/10萬電子天平（日本島津）；S-4800型場發射掃描電鏡（日本日立公司）；ZetasizerNano型馬爾文激光粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）；Leica TCS-SP5 激光共聚焦顯微鏡（德國）；小動物多光譜活體成像係統為Maestro 2（CRI，Woburn，MA，USA），該係統主要由液晶可調諧濾光片和科研級電荷耦合器件（CCD）組成，液晶可調諧濾光片掃描範圍 500～950 nm，掃描帶寬、步進均為 10 nm，數據采集、光譜分離處理過程均由Maestro多光譜分析軟件完成。
PLGA（LA-GA 50∶50，平均相對分子質量15 kDa，山東省醫療器械研究所）；聚乙烯醇（PVA 1788，上海阿拉丁試劑有限公司）；尼羅紅（Nile red，美國Sigma-Aldrich公司）；DiR（美國AAT Bioquest公司）；醋酸乙酯（EA，上海國藥）；無水乙醇（分析純，中國醫藥集團上海試劑公司）；丙酮（分析純，上海淩峰化學試劑有限公司）。
SPF級BALB/c裸鼠，6～8周齡，18～20 g，合格證號SCXK（滬）2012-0006，上海傑思捷實驗動物有限公司，實驗前24 h禁食不禁水。
2 方法
2.1 快速膜乳化法製備 PLGA 納米粒[8-9]
將 PLGA 溶於醋酸乙酯中作為油相（過 0.45 μm 微孔濾膜除去不溶物），一定濃度的 PVA水溶液作為水相（使用前過 0.45 μm 微孔濾膜），水相加入油相，均質乳化製備成油/水（O/W）型預乳液（12 000 r·min-1，45 s）。將其倒入快速膜乳化裝置中，在一定的氮氣壓力下反複過膜，在過膜後的乳液中加入6倍體積 0.5% PVA水溶液以萃取其中的醋酸乙酯，常溫下磁力攪拌 6 h，離心（16 000 r·min-1，10 min），用蒸餾水洗滌納米粒 3 次，冷凍幹燥，即得 PLGA空白納米粒。包載DiR納米粒的製備：與空白納米粒製備相同，隻是在有機相中加入適量DiR。
2.2 不同方法製備PLGA納米粒比較研究[11]
二元溶劑分散法製備PLGA納米粒：將PLGA溶於丙酮和無水乙醇混合溶液，過0.45 μm微孔濾膜除去不溶物，將上述有機相在磁力攪拌下，使用0.4 mm注射器針頭，以一定速度滴入PVA溶液（使用前過0.45 μm微孔濾膜）中，磁力攪拌 10 min，將產物經旋轉真空蒸發除去有機溶劑，經0.8 μm微孔濾膜過濾，離心水洗，冷凍幹燥，即得納米粒。
超聲法製備PLGA納米粒：將PLGA溶於醋酸乙酯作為油相（過0.45 μm微孔濾膜除去不溶物），一定濃度的PVA水溶液（使用前過0.45 μm微孔濾膜）作為水相，將水相加入油相中，超聲（500 W，3 min）乳化製備成油/水（O/W）乳液，在乳液中加入6倍體積 0.5% PVA 水溶液以萃取其中的醋酸乙酯，常溫下磁力攪拌 6 h，離心水洗，冷凍幹燥，即得納米粒。
快速膜乳化法製備PLGA納米粒：參照2.1項下方法製備PLGA納米粒，其中油相PLGA質量濃度為20 g·L-1，水相PVA質量濃度為20 g·L-1，油水比1∶5，過膜壓力1 150 kPa，過膜3次。
2.3 表麵形貌和粒徑分布的測定
將納米粒分散在去離子水中，滴加到鋁箔紙（錫紙）上，使其均勻攤開，自然晾幹。剪下一小塊鋁箔用導電膠固定在樣品台上，真空條件下噴金（30 mV，120 s），利用掃描電子顯微鏡觀察納米粒形態。
2.4 納米粒粒徑分布的測定
將納米粒懸浮在去離子水中，采用帶亞微米級粒徑分析功能的 Zeta 電位儀測定平均粒徑及多分散係數（PDI），PDI越小代表納米粒粒徑分布越均勻。
2.5 藥物分布模擬研究[12-14]
由於本實驗使用的激光共焦顯微鏡無法對納米級粒子進行有效觀察，因此，以大孔徑膜（10 μm）代替1 μm膜製備微球使其在儀器成像範圍之內。選取脂溶性尼羅紅為模型藥物，采用快速膜乳化法製備微球，模擬藥物在微球中的分布。方法如下：取200 mg PLGA 溶於10.0 mL醋酸乙酯溶劑中作為油相，油相中加入一定量尼羅紅，然後將其倒入一定量含PVA水溶液，磁力攪拌形成初乳。將其倒入快速膜乳化裝置中，在40 kPa的氮氣壓力下反複過膜3次，在過膜後的乳液中加入6倍體積的0.5% PVA水溶液，磁力攪拌6 h去除油相中醋酸乙酯，得到PLGA微球。離心、蒸餾水洗滌3次，收集沉澱，將該沉澱混懸於水中，冷凍幹燥，樣品於4 ℃保存。取凍幹後微球采用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，設定Z軸方向上采集的第一張和最後一張確定掃描區域，設置Z軸步進，進行隨機斷層掃描，同時計算機圖象分析，激發波長543 nm，發射波長588～688 nm。
2.6 納米粒體內靶向性研究
文獻研究[15-16]包載DiR的PLGA納米粒體外釋放，結果表明在48 h內納米粒體外累積釋放率分別低於0.9%，1%。因此，包載DiR納米粒可以作為示蹤粒子，研究納米粒在體內的動態分布情況。實驗過程：采用水合氯醛腹腔注射使裸鼠處於麻醉狀態，分別給裸鼠尾靜脈注射相同劑量的DiR納米粒（給藥組）、DiR熒光染料（染料對照組），在7，20 min，3 h（3 h時處死裸鼠，取心、肝、脾、肺、腎）采用小動物活體熒光成像技術對裸鼠腹部進行拍照，采集圖像信息。熒光成像以730 nm作為DiR的激發光波長，以790 nm作為發射光波長，自動掃描獲取每次圖像采集的曝光時間，以使成像水平達到最佳狀態，確定示蹤納米粒在裸鼠體內不同組織的分布情況。
3 結果
3.1 快速膜乳化工藝優選
3.1.1 膜孔徑的選擇 采用快速膜乳化法製備微粒，考察不同膜孔徑對微粒製備的影響。分別選擇了膜孔徑為20（以常規磁力攪拌製備初乳[17]），4，2，1 μm的膜，在30，700，900，1 150 kPa壓力下過膜，所製備粒子的平均粒徑和PDI分別為6 357 nm，0.149； 880.1 nm，0.106；532.2 nm，0.090；355.7 nm，0.012。掃描電鏡圖。隨著孔徑的減小，粒子的粒徑變小，粒徑更均一。