1850年2月25日，道光帝死去，第四子奕寧繼立，於次年改元鹹豐，鹹豐二年底（1853年初）江南舉行鄉試，馬相伯趕回家鄉丹陽應試。丹陽地方風氣閉塞，一些讀書人，怕馬相伯占了生員名額，便放出風來說：“馬相伯妄信夷洋教，應試天朝，尤屬不可。”馬相伯受不得這等閑氣，就由丹徒入泮，他對試卷中的四書經義及詩和策問等答得還十分順當。
正月初旬，陰霾氣寒，日色無光，太平軍攻下武昌，順長江東下，一個月內連下九江、安慶等省會，直達南京。3月19日，太平軍用10天時間攻下南京，定為都城，改稱天京。因太平軍攻入江蘇，馬相伯沒等到出榜，就匆匆回到上海，繼續在徐彙公學讀書。這天，馬相伯和幾個小同學到教堂幫忙搭彩，教堂高處有一條彩布，沒有敢去懸掛，他卻自告奮勇爬上扶梯。平時，他對學生義務勞動從來不落人後，總是熱心去做。馬相伯剛踏上最高一級時，忽然扶梯和人一同翻倒在地，當場暈過去，好幾小時不知人事，經校方搶救才醒來。在場的其他幾位小同學嚇得要命。事後，馬相伯仍和以前一樣，搶著做事，師生都很佩服他這種公而忘私的奮勇精神。
太平軍攻占鎮江、揚州等地時，馬鬆岩將全家老小安置在金壇、武進之間的一湖島中，放心不下，就趕到上海看望相伯。馬鬆岩同兒子談論了半天，晚上合睡一室，到深更半夜，起身打點行裝，馬相伯醒來不解地問：“爸爸，你半夜打行李做啥？”父親歎道：“我夢見你姆媽和姐弟，都被太平軍捉去了。”馬鬆岩連夜雇民船駛向湖島，將全家遷陡到上海。9歲的馬建忠也進了徐彙公學讀書。
公學校長是晁德蒞神父，是意大利人，精於漢學，國文教師是海門黃伯祿，中西文學造諧俱深。馬相伯由於資質聰穎，學習勤奮，校長晁德蒞對他十分重愛，他替馬相伯兄弟倆取名，相伯叫“馬斯藏”，馬建忠叫“馬斯才”。馬相伯得到黃伯祿教師的傳授，學業猛進。晁德蒞校長看到他的中國文學基礎很好，就叫14歲的馬相伯擔任低班的國文和經學的教員，他既做學生，又當先生，進步更快。晁校長常對人說：“人家說中國人缺少感情，我從馬生身上看到中國人的感情，實在比西洋人來得豐厚。”
馬相伯到了18歲時，法文和拉丁文都學得很好，聲譽由師友之間傳到上海法租界，法國領事用重金聘請他為秘書，這是份令人羨慕的工作，可他婉辭了這份美差：“我學法語，是為中國人用的。”他繼續在校學習，吸取了不少新科學知識，對數學、化學、物理特別感興趣，他在徐彙公學讀了8年，在畢業時獲得獎賞。
1860年4月，太平軍攻入蘇州，進逼上海，英法宣布保衛租界，美國人華爾得到上海巨商楊坊及蘇、淞、太道吳煦資助，組成了洋槍隊，徐彙公學學生到董家渡避難。學友派馬相伯到蘇州、太倉等地，救護難民，馬相伯全心投入，累出傷寒病，僵臥了兩個多月，有40天不進飲食，氣息懨懨，幾乎死去。病後，他頭發全部脫落，成了禿頭，從前所讀的書，也忘得一幹而淨。有一年多時間，他拿書本竟一字不認，像個白癡，好歹父親是行醫的，對相伯精心調養，精心醫療，等到身子完全恢複後，馬相伯拚命用功，才慢慢恢複原狀，家裏人嚇得半死，他輕鬆地開玩笑說：“有萬能的主保佑，有大難也死不了。”
愛國誌士
1931年“九·一八”事變爆發，日本侵占我國東北三省，此時馬相伯已92歲高齡，他深感國難深重，救國有責，於是不顧衰頹，奮力救之。他發表演說，撰寫文章，號召團體，呼籲人民自救，被譽為愛國老人，達到他一生的光輝頂點。此時馬相伯右腳癱瘓，行動不便，家人們怕他整天不停寫字太苦累，但又不敢勸休息。因為馬相伯最喜歡孫女馬玉章，家人就讓她做工作，馬玉章便說：“爺爺，我磨墨磨得很累，能不能休息一下？”可馬相伯發火了：“前線將士為了抗日連命都不要，你磨這點墨就什麼酸啊酸的！”為支援東北義勇軍，他不辭辛苦，親自書寫“壽”字和對聯義賣。每一壽字30元，一副對聯50元，短短幾天內便將義賣款十萬元全部送往前線支援馬占山、馮玉祥抗日軍隊。