在上海歡迎馬占山的集會上，94歲的馬相伯親自參加，他激情地斟滿了一杯酒，站起來說：“這第一杯酒是恭賀馮玉祥將軍收複察哈爾四縣，並盼望他更多收複失地。第二杯酒才是歡迎馬占山將軍。”“九·一八”事變不久，馬相伯發表《為日禍敬告國人書》，提出全國人民“自贖自救”、“自息內爭，共禦外侮”、“對內絕對不多枉費一槍彈，對外必不許嗇惜一槍彈”的著名主張，反對國民黨的內戰政策，他曾提出《國難人民自救建議》和《實施民治促進憲政以紓國難案》，並發起組織中國民治促進會、江蘇國難會和不忍人會。先後在上海《申報》上發表了《新年告青年書》、《泣告青年書》、《為日禍敬告國人書》等主張不買日貨，研究科學，喚起民眾，號召為抗日將士勸募義捐。1932年“一·二八”滬抗戰時，土山灣地處華界，親友請他遷居租界以保安全，馬相伯謝絕，獨居危樓。樓前廣場，曾落敵彈，他處之泰然。在馬相伯建議下，丹陽旅滬同鄉會從戰區搶救難民3000多人陸續遣返回鄉。馬相伯對家人說：“國家存亡，不單不是匹夫有責，你們婦女也有責任。”
在他的啟示下，他兒媳等聯絡了幾位婦女自己買了一些醫療用品，在震旦大禮堂辦了傷兵醫院，多名戰士傷愈歸隊。十九路軍蔡廷鍇派參謀長張仲昌向馬相伯兒媳致謝，馬玉章也得了全國紅十字獎。淞滬戰役後，日酋鬆津中將在開慶祝會時被朝鮮誌士金某炸斷了一條腿，日寇猖狂地在上海四處追捕，金某處境很危險，馬相伯兒媳贈送盤纏並設法救他逃出上海。
對於蔣介石的不抵抗主義，馬相伯非常不滿，曾經說：“終身委員長就是皇帝，委員長做了這許多年，失地也失得不少了，難道委他的人民不應該有所表示麼？”蔣介石50歲時，曾托很多人求馬相伯給他寫個“壽”字以討吉利，馬相伯不肯，學生林騶勸道：“先生給他一點麵子罷！”馬相伯以“吉一時”三字合成一繁寫“壽”字，旁注“籠罩一切時期，無往不利。”蔣介石得到後大喜，如獲至寶，又派人向老人家道謝。人走後，馬相伯哈哈大笑，兒媳感到奇怪，便對女兒馬玉章說：“看你爺爺的高興勁兒啊！”馬相伯的臉拉長：“你胡說什麼了，我笑的是我叫這小子‘吉一時’，旁注的‘無往不利’，是說不論什麼時候都無‘望’不利了，可他還很高興，這不可笑嗎？”從此“這小子”三字成了馬相伯稱呼蔣介石的別名。
馬相伯看到震旦學生朱叔和曾問他：“這小子會打仗不會？”“這小子打仗了沒有？”朱叔和開始不明白“這小子”是誰，後來才明白是指蔣介石。1932年，馬相伯參加宋慶齡、魯迅等組織的“中國民權保障同盟”。1934年，馬相伯95歲生日，少長鹹集，群賢畢至前來祝壽，26人合起來共1470歲，大家稱之“千歲集”，馬相伯首製一詞，調寄《千秋歲》詞雲：“江山破碎，望眼空垂淚，吾老矣，言何忌！椎難沙浪博，筆柱鋒頭出，傷心也、史（魚酋）已死春秋弛。國難無時已，有酒今朝醉，少長集，群賢萃，老髦耆耋艾，醵成千歲，君知否？掀髯一笑昭光逝。”吳興姚勁秋丈作白雁圖，金山高吹萬丈作鬆壽圖，陸規亮首製長歌為壽，沈信卿、黃炎培、陳陶遺、高吹萬、沈思齊、王培孫等都有詩，之後大家合影。
1935年12月，上海文化界人士組織救國會，由於馬相伯的社會地位和救國熱情，被公認救國領袖，一切通告，文件均由他領銜。1936年7月，他與宋慶齡等發了成立“全國各界救國聯合會”，要求國民黨政府停止內戰，釋放政治犯，建立抗日統一政權。全國各界救國會第二次執委會是在馬相伯寓所樂善堂開的，馬相伯特別寫了“恥莫大於亡國，戰雖死亦猶生”的對聯送給出席的各委員。
同年11月，救國會沈鈞儒、鄒韜奮、李公樸、沙千裏、史良、章乃器、王造時七君子被國民黨當局逮捕時，馬相伯和宋慶齡、何香凝等發表宣言呼籲愛國無罪，他又打電報給馮玉祥，其中有“老夫願以頭顱作保。”蔣介石對於右任說：“你先生鬧得實在太凶了！”於右任不得不叫天主教主教來南京，由主教於斌出麵請他到南京襄理教務。馬相伯聽說江南教區有了中國主教，很高興地說：“我是中國人，應該歸向中國的教區去！”他不顧眾人的勸阻決定去南京。宋慶齡懂得老人的心意，便說：“馬先生既然答應去南京，就讓他去罷，在南京也一樣可以和我們領導抗日之運動的。”
1936年11月24日，馬相伯離開上海，清晨之時，宋慶齡對馬相伯秘書萬國華和馬家人說：“你們要千萬照顧好老先生身體，老先生是國寶呀！”馬相伯在赴南京時，將他在上海寓所樂善堂全部藏書8700餘冊，捐獻給丹陽相伯圖書館。在交付藏書時，他向家人懇切囑咐注意五點：（1）過目成誦，是人們的天才，讀書得間，在人們的學習。（2）兀兀窮年，方知老夫手不釋卷的回味。（3）鑽在故紙堆中，要活讀，才免做蠹蟲。（4）學海茫茫無梁筏，留心我下的苦功夫，便知所選擇。（5）有些書成了海內外的孤本，應該愛惜更加勤讀。