李時珍為了獲得第一手材料，還創造性地采用了解剖藥用動物、作動物實驗等方法，甚至還拿自己來作實驗。例如關於生薑，梁代陶弘景認為不能常吃，不然會“傷心氣”。唐代蘇恭則引證《神農本草經》的記載反對，認為可以常吃，並說陶弘景之所說是毫無根據的胡說。唐代的孫思邈則也認為不能經常吃生薑，不然會患眼病，甚至“損壽減筋力”。生薑到底能不能常吃呢？李時珍就試驗著常吃生薑，果然得了眼病。待眼病好了以後再常吃生薑，果然又患了眼病。這樣反複試驗幾次後，李時珍確信生薑不能常吃，便記下“食薑久，積熱患目”。
李時珍經過27年的不懈努力，積累了極其豐富的第一手資料，經過三年認真徹底的修改，到61歲時，寫出了《本草綱目》初稿，此後又經過十多年的修改，直到73歲時才最後定稿。李時珍編著《本草綱目》，前後花了近40年的時間，傾注了畢生的心血，耗費了畢生的精力。遺憾的是，李時珍生前未能親自看到《本草綱目》的出版，直到了他逝世後的1596年，《本草綱目》才在金陵（今南京）出版。
《本草綱目》全書約190萬字，共52卷，收載藥物1892種，有描繪藥物形態的圖譜1110幅，附載醫方11096個。這部內容豐富的藥物學著作，不僅在中國古代是空前的，在世界古代醫學史上也是罕見的。它的重大貢獻，首先在於它係統而正確地總結了16世紀以前中國人民長期的藥用經驗和理論知識。李時珍不僅整理了曆代本草所錄的全部藥物1518種，而且還增添了374種，並且對從前未曾敘述過的一些藥物的效用進行了補充敘述。這類藥物竟達1300條以上。其次，《本草綱目》改正了曆代本草著作中的許多錯誤，批判了種種違反科學、危害人民生命健康的謬說。《本草綱目》的廣博內容，對自然科學的其它學科，如中醫學、生理學、營養學、植物學、動物學、礦物學、化學、地質學、天文學等多方麵，都有相當的貢獻。16世紀歐洲藥物學著作中的《寇大斯藥物學》以及被譽為“阿拉伯醫師之王”的阿維森納的《醫典》都遠遠地不能和《本草綱目》相比。17世紀後《本草綱目》被陸續譯成各種文字，對世界近代和現代醫藥學的發展產生了重大影響。
李時珍一生艱苦卓絕的實踐告訴我們：“世上無難事，隻要肯登攀。”“鍥而不舍，金石可鏤”。